Uji Daya Hambat

 Aktivitas atau potensi antibakteri dapat ditujukkan pada kondisi yang sesuai dengan efek daya hambat terhadap mikroorganisme. Suatu penurunan aktivitas antimikroba juga dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia sehingga pengujian secara mikrobiologi atau biologi biasanya merupakan standar untuk mengatasi keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas.

 Ada dua metode umum yang dapat digunakan, yaitu penetapan dengan lempeng silinder atau cara “lempeng” dan penetapan dengan turbidimetri atau cara “tabung”. Metode pertama berdasarkan difusi antibiotik dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng. Jadi mikroorganisme yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada daerah berupa lingkaran atau “zona” di sekeliling silinder yang berisi larutan antibiotik. Metode turbidimetri berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan mikroorganisme dalam larutan antibiotik serba sama dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroorganisme dengan cepat jika tidak terdapat antibiotik (Harmita & Radji, 2008:12)

Penetapan dengan metode lempeng dan metode turbidimetri, semua peralatan harus dicuci bersih sebelum dan sesudah digunakan. Peralatan gelas, untuk menyimpan dan memindahkan mikroorganisme uji, disterilkan  dengan pemanasan kering atau dengan uap air (Harmita & Radji, 2008:12).

 Pengendalian termostatik diperlukan dalam beberapa tahap penetapan secara mikrobiologi, yaitu pada saat membiakkan mikroorganisme dan penyiapan inokula, serta selama inkubasi dalam penetapan pada lempeng dan tabung. Suhu dengan penetapan lempeng dipertahankan lebih kurang 0,5^oC dari suhu yang dipilih. Pengendalian suhu yang lebih dekat (lebih kurang 0,1^oC dari suhu yang dipilih) sangat penting untuk diinkubasi pada penetapan dengan cara tabung. Hal ini dapat dicapai dengan mengatur sirkulasi udara atau air; kapasitas panas dari air yang lebih besar lebih menguntungkan dari pada sirkulasi udara (Harmita & Radji, 2008:12).

Pengukuran transmitan dalam pita frekuensi yang sempit membutuhkan spektrofotometer yang sesuai dan mempunyai sumber cahaya yang panjang gelombang yang dapat diubah atau dibatasi dengan menggunakan filter 530 nm untuk pengukuran serapan pada pengujian dengan cara tabung. Untuk tujuan tersebut, alat dapat diatur sehingga dapat menerima tabung yang digunakan untuk inkubasi dan menggunakan sel yang dimodifikasi, yang dilengkapi dengan pipa pembuangan untuk memudahkan pertukaran isi dengan cepat, atau lebih disukai sel yang mempunyai saluran untuk pengaliran secara sinambung selama pengukuran. Atur serapan dengan blanko untuk serapan nol menggunakan media cair yang jernih tanpa inokula yang disiapkan seperti yang dinyatakan untuk masing-masing antibiotik, termasuk larutan uji dan formaldehida dalam jumlah yang sesuai dalam setiap contoh. (Catatan pengukuran serapan dan transmitan dapat digunakan untuk penyiapan inokula) (Harmita & Radji, 2008:13) .

             Untuk penetapan cara lempeng, gunakan cawan petri kaca atau plastik (lebih kurang 20 mm x 100 mm) yang mempunyai tutup dari bahan yang sesuai. Untuk silinder, gunakan silinder besi tahan karat atau porselen dengan toleransi ukuran masing-masing lebih kurang 0,1 mm; diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, dan tinggi 10 mm. Cuci silinder dengan seksama untuk membersihkan semua residu, kadang-kadang diperlukan asam seperti asam nitrat 2 N atau asam kromat (Harmita & Radji, 2008:13).

 Media yang diperlukan untuk inokula mikroorganisme terbuat dari bahan-bahan yang tertera pada kontak. Sedikit modifikasi pada masing-masing bahan, atau media kering yang direkonstitusi, dapat dilakukan dengan syarat media yang dihasilkan mempunyai daya menumbuhkan yang sama atau lebih baik dan memberikan respons kurva baku yang sama (Harmita & Radji, 2008:13).