Metoda Uji Aktivitas Antidiabetes

Ekstraksi sampel.

            Sebanyak 1,5 Kg sampel segar dipotong kecil-kecil (3-5 mm), lalu dimaserasi dalam etanol 96 % selama 5 hari sambil sesekali diaduk, sari etanol disaring, dan ampas dimaserasi kembali dengan perlakuan yang sama  sebanyak 2 kali. Maserat dikumpulkan lalu diuapkan dengan destilasi vakum, kemudian dikentalkan dengan rotary evaporator.

Penyiapan sediaan uji.

            1. Perencanaan Dosis Ekstrak

                Ekstrak diuji efek antidiabetesnya dengan pemberian dosis menurun kelipatan 2 dari uji skrining, yaitu 500, 250, dan 125 mg/kg. Untuk mencapai dosis tersebut dibuat sediaan suspensi ekstrak dengan konsentrasi tertentu. Volume sediaan uji yang diinjeksikan ke alam tubuh mencit adalah 2 % dari berat badan.

            2. Penyiapan Konsentrasi Ekstrak

                Pada pemberian ekstrak dengan volume 2 % dari  berat badan, maka untuk dosis 500 % mg/kg konsentrasi ekstrak yang dibuat adalah sebanyak 2,5 %, untuk dosis 250 mg/kgBB konsentrasi ekstrak adalah sebanyak 1,25 % sedangkan untuk dosis 125 mg/kgBB konsentrasi ektrak yang dibuat adalah sebanyak 0,625 %. Suspensi ekstrak dibuat rp masing-masing sebanyak 10 ml.

Penginduksian diabetes dan pemberian ekstrak

            1. Penginduksian Diabetes

                Mencit yang akan diinduksi diabetes dipuasakan selama 18 jam (air minum tetap diberikan), diinjeksi dengan larutan aloksan tetrahidrat ( yang dibuat baru) secara intraperitonial dengan dosis 200 mg/kgBB. Mencit diberi makan pelet dan minum yang mengandung glukosa 10% selama 2 hari setelah pemberian aloksan. Hari ke-3 dan seterusnya glukosa 10 % diganti dengan air minum biasa dan mencit dipindahkan ke kandang metabolik yang tiap kandang berisi satu ekor mencit. Pada hari ke-3 itu juga ditentukan kadar glukosa darah mencit, apabila positif diabetes langsung diberi ekstrak tanaman obat. Mencit yang digunakan adalah bila kadar gula darahnya ≥ 200 mg/dl.

            2.Tahap Pemberian Ekstrak

                Mencit putih jantan diabetes dibagi 5 kelompok percobaan secara acak dimana setiap kelompok terdiri deri 5 ekor. Kelompok 1 merupakan mencit kontrol yang hanya diberikan suspensi NaCMC. Kelompok 2 adalah mencit diabetes yang diberi suspensi NaCMC. Sedangkan kelompok 3,4,5, adalah kelompok mencit diabetes yang diberi ekstrak senyawa secara oral sekali sehari selama  hari masing-masing dengan dosis 125, 250, dan 500 mg/kgBB mulai hari ke-1 dinyatakan diabetes.

Penentuan kadar gula darah hewan percobaan.

            Pada hari ke-3, 5, 7 dan 10 setelah mencit diinduksi dengan aloksan, darah diambil dari ekor mencit kemudian kadar glukosa darah ditentukan dengan menggunakan alat GlukoDrTM Blood Glucose Test Meter.

Pengukuran Berat Badan.

            Berat badan mencit diukur dengan penimbangan pada hari ke-1, 4, 7 dan 10 dengan menggunakan timbangan Tripel beam balance model 700.

Pengukuran konsumsi air minum mencit diabetes.

            Pengukuran konsumsi air minum dilakukan dengan cara memberikan air minum pada mencit dengan volume terukur kemudian setelah 24 jam volume sisa air minum yang tertinggal diukur kembali. Selisih volume air yang diberikan dengan air yang tertinggal dihitung sebagai volume air minum. Konsumsi air minum diukur setiap harinya pada hari ke-3,5,7 dan ke 10.

Pengukuran volume urin mencit.

            Pengukuran jumlah urin yang dihasilkan mencit dilakukan dengan mengukur volume urin yang dikumpulkan setiap 24 jam. Volume urin yang dihasilkan tiap mencit diukur dengan gelas ukur setiap hari pada hari ke-3, 5, 7 dan ke-10. Untuk memudahkan pengumpulan urin mencit dimasukkan ke dalam kandang metabolik yang pada bagian dasarnya diberi penyaring agar didapatkan urin yang bersih.

Penetuan berat relatif organ jantung, hati dan ginjal.

            Pada hari terakhir perlakuan jantung, hati dan ginjal diambil. Organ dikeringkan dengan kertas saring kemudian ditimbang dan ditentukan berat relatif organ dengan menggunakan persamaan

            BRO = BO

                         BB

            Keterangan:

            BRO = Berat Relatif Organ Mencit

            BO   = Berat Organ Mencit

            BB   =  Berat Badan Mencit

Analisa Data

         Dari hasil penelitian dianalisa secara statistik dengan ANOVA dua arah untuk parameter kadar glukosa darah, berat badan, konsumsi air minum 24 jam dan volume urin 24 jam, sedangkan berat organ Relatif dianalisa dengan ANOVA satu arah. Jika hasil analisa bermakna kemudian dilanjutkan dengan Uji Wilayah Berganda Duncan (Duncan’s multiple range test.

Uji Aktivitas Antidiabetes metoda inhibisi enzim α-glukosidase secara invitro

Uji antidiabetes dilakukan dengan menggunakan metoda inhibisi enzim α-glukosidase secara invitro(Sancheti et al, 2009). Metoda ini dilakukan dengan menggunakan substrat p-NPG dan enzim α-glukosidase dimana enzim α-glukosidase akan menghidrolisis substrat p-NPG menjadi α-d glukosa dan p-nitrofenol (berwarna kuning). Sampel dari ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol masing-masing ditambahkan ke dalam campuran substrat dan enzim, diharapkan akan menghambat kerja enzim sehingga akan mengurangi terbentuknya glukosa dan intensitas warna kuning dari p-nitrofenol yang terbentuk. Aktivitas inhibisi enzim ini diukur berdasarkan warna kuning hasil reaksi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm (Sancheti et al, 2009).

 

              Penyiapan Larutan Pereaksi Uji Inhibisi Enzim α-Glukosidase

1.      Larutan buffer fosfat pH 7

Larutan buffer fosfat pH dibuat dari campuan 1,361 gr potassium dihidrogenphosphate dalam 100 ml pelarut. Untuk mendapatkan pH 7 ditambahkan 35 grdisodium hidrogen phosphate lalu ditambahkan aquades hingga 1000 ml.

2.       Larutan natrium karbonat 0.1 M

Sebanyak 0.53 gr natrium karbonat dilarutkan dalam 50 ml aquades.

3.       Larutan enzim 0.2 unit

Sebanyak 1 mg enzimα-Glukosidasedilarutkan dalam 10 ml buffer fosfat saline pH 7 yangmengandung 20 mg Bovin Serum Albumin.

4.       Larutan substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (p-NPG) 20 mM

Larutan substrat p-NPG dengan konsentrasi 20 mM dibuat denganmenimbang sebanyak 0.1507 p-NPG dan dilarutkan dalam 25 ml buffer fosfatpH 7.

Penyiapan Larutan Uji

      1.      Penyiapan larutan akarbose

Sebanyak1 gram tablet glucobay® (akarbose) yang jumlahnya 4 tablet dengan kandungan akarbose 100 mg/tablet digerus kemudian dilarutkan dalam buffer fosfat pH 7 dan HCl 2Ndengan perbandingan (1:1) sebanyak 100 ml untuk mendapatkan konsentrasi 1000 ppm, kemudian disentrifus lalu bagian ssupernatannya diambil dan dilakukan pengenceran hingga 100 ppm untuk pengujian inhibisi dan dibuat serial konsentrasi 1 ppm; 0,5 ppm; 0,25 ppm; 0,125 ppm dan 0,0625 ppm.

2.      Penyiapan larutan sampel ekstrak

Ekstrakn-heksan, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol masing-masing ditimbang 10 mg, kemudian dilarutkan dengan penambahan DMSO 1 ml danditambahkan bufer fosfat hingga mencapai volume 10 ml untuk mendapatkan kosentrasi 1000 ppm sebagai larutan induk, kemudian pipet 500 μl dari larutan induk encerkan dengan penambahan bufer fosfat 500 μl untuk kosentrasi 500 ppm begitu seterusnya untuk pembuatan konsentrasi 250 ppm, 125 ppm dan 62,5 ppm.

Uji inhibisi enzim α-glukosidase secara invitro

1. Pengujian Kontrol Blanko (B₀)

Pada microplat reader 96 well, 10 μl DMSO dicampurkan dengan 50 μlbuffer fosfat (pH 7), 25 μl p-NPG20 mM lalu inkubasi selama 30 menit pada suhu37°C. Setelah 30 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan 100 μl larutan 0,1M Na₂CO₃, lalu absorban dari p-nitrofenol diukur pada panjang gelombang 410nm dengan spektrofotometer UV Vis.

             2.Pengujian Blanko (B₁)

Pada microplate reader 96 well, 10 μl DMSO dicampurkan dengan 50 μl buffer fosfat (pH 7), 25 μl p-NPG20 mM, 25 μl α-glukosidase (0,2 U/ml) lalu inkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Setelah 30 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan 100 μl larutan Na₂CO₃0,1 M, lalu absorban dari p-nitrofenol diukur pada panjang gelombang 410 nm dengan spektrofotometer UV Vis.

              3.Pengujian Kontrol Sampel (S₀)

Pada microplat reader 96 well, 10 μL sampel 1000 ppm ditambah dengan 50 μl buffer fosfat (pH 7), 25 μl p-NPG 20 mM lalu inkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Setelah 30 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan 100 μl larutan Na₂CO₃0,1 M, lalu absorban dari p-nitrofenol diukur pada panjang gelombang 410 nm dengan spektrofotometer UV Vis. Dilakukan pengujian yang sama pada serial kosentrasi 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm dan 62,5 ppm.

             4.Pengujian Sampel (S1)

Pada microplat reader 96 well, 10 μL sampel 1000 ppm ditambah dengan 50 μl buffer fosfat (pH 7), 25 μl p-NPG20 mM, 25 μl α-glukosidase (0,2 U/ml) lalu inkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Setelah 30 menit reaksi dihentikan dengan penambahan 100 μl larutan Na₂CO₃0,1 M, lalu absorban dari p-nitrofenol diukur pada panjang gelombang 410 nm dengan spektrofotometer UV Vis. Dilakukan pengujian yang sama pada serial kosentrasi 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm dan 62,5 ppm.

           5.Pengujian kontrol acarbose sebagai kontrol positif (A₀)

Pada microplat reader 96 well, 10 μL Akarbose 1 ppm ditambah dengan 50 μl buffer fosfat (pH 7), 25 μl p-NPG 20 mM lalu inkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Setelah 30 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan 100 μl larutan Na₂CO₃0,1 M, lalu absorban dari p-nitrofenol diukur pada panjang gelombang 410 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Dilakukan pengujian yang sama pada serial kosentrasi 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,0625 ppm.

           6.Pengujian acarbose sebagai kontrol positif (A₁)

Pada microplat reader 96 well, 10 μL Akarbose 1 ppm ditambah dengan 50 μl buffer fosfat (pH 7), 25 μl p-NPG 20 mM, 25 μl α-glukosidase (0,2 U/ml) lalu inkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Setelah 30 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan 100 μl larutan Na₂CO₃0,1 M, lalu absorban dari p-nitrofenol diukur pada panjang gelombang 410 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Dilakukan pengujian yang sama pada serial kosentrasi 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,0625 ppm.

             Analisa Data

Persen inhibisi digunakan untuk menentukan persentase hambatan dari suatu bahan yang dilakukan terhadap aktivitas enzim α-glukosidase (Romansyah, 2011). Data hasil penelitian dalam bentuk absorban kemudian dikonversikan ke dalam % inhibisi dan dianalisa secara statistik deskriptif untuk melihat adanya aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase pada sampel turunan calkon dengan menggunakan rumus (Bachhawat et al, 2011):

% inhibisi = Ak -As× 100%

Ak                          

Keterangan :    Ak: Absorbansi Kontrol

As: Absorbansi Sampel

Nilai persen inhibisi yang telah dihitung dari setiap konsentrasi selanjutnya digunakan untuk perhitungan IC50.IC50 atau Inhibitor Concentration 50% adalah nilai konsentrasi suatu bahan untuk menghambat aktivitas enzim α-glukosidase sebesar 50%. Nilai konsentrasi dari larutan yang telah diencerkan dari ekstrak dan persen inhibisi diplotkan pada sumbu x dan y. kemudian nilai IC50 dihitung denganregresi non linear y = a ln(x) + b.

Keterangan:

y: % Inhibisi

x: Konsentrasi sampel

a: Intersep

b: Slope