METODE KROMATOGRAFI

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Teknik kromatografi telah berkembang dan telah digunakan untuk memisahkan berbagai macam komponen yang kompleks baik komponen organik maupun komponen anorganik

(Ganjar dan Rohman, 2007). Ada beberapa metode kromatografi yang dilakukan dalam isolasi senyawa bahan alam yaitu kromatografi cepat, kromatografi kolom, kromatografi ekslusi, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

Kromatografi cepat atau flash chromatography termasuk dalam kromatografi kolom. Konsep flash chromatography sangat sederhana dalam pemisahan preparatif. Kromatografi jenis ini biasanya menggunakan kromatografi kolom biasa yang dimodifikasi. Cara ini sangat mudah dan murah dilakukan karena hanya menggunakan alat-alat gelas. Oleh karena itu metode ini banyak sekali digunakan oleh para peneliti yang bekerja dalam masalah pemisahan (Hostettmann et al., 1997).

Kromatografi cepat atau flash chromatography digunakan sebagai usaha untuk memperpendek waktu kerja dari kromatografi kolom terbuka. Pemisahan dilakukan dengan memberikan tekanan pada kolom berupa udara bersih atau gas nitrogen yang berfungsi untuk mempercepat proses pemisahan tersebut. Fase diam yang digunakan pada kromatografi cepat  adalah silika gel yang memiliki ukuran partikel 40 – 60 μm (230 – 400 mesh) (Cannell, 1998). Ukuran partikel yang kecil memberikan luas permukaan yang besar dan keseragaman meningkatkan resolusi. Ukuran kolomnya berdiameter antara 3-10 cm dan panjangnya 7-15 cm

(Colegate dan Molyneux,1993).

Kromatografi kolom merupakan salah satu metode kromatografi dengan fase gerak cair dan fase diam padat. Penggunaan fase gerak (eluen) disesuaikan dengan kepolaran senyawa yang akan dipisahkan. Fase diam ditempatkan dalam tabung kaca berbentuk silinder, pada bagian bawah tertutup dengan katup atau kran dan fase gerak dibiarkan mengalir ke bawah karena gaya berat.

Pada kondisi yang dipilih dengan baik, eluen yang merupakan komponen campuran, turun berupa pita dengan laju yang berlainan dan dengan demikian dipisahkan. Eluen biasanya dipisahkan dengan cara membiarkannya mengalir keluar dari kolom dan mengumpulkannya sebagai fraksi. Jenis absorben yang paling banyak digunakan dan mudah didapat berupa alumina dan silika gel (Gritter et al.,1991).

Kromatografi ekslusi disebut kromatografi permeasi gel jika digunakan fase gerak organik atau kromatografi filtrasi gel jika digunakan fase gerak yang mengandung air, yang merupakan metode pemisahan yang tergantung pada pertukaran molekul terlarut di antara pelarut fase gerak dalam  pori-pori bahan pengisi kolom yang menentukan rentang ukuran molekul pada pemisahan yang terjadi. Pemisahan dengan kromatografi ekslusi (Sephadex-LH20) biasanya digunakan pada campuran yang memiliki perbedaan berat molekul yang besar. Hasil pemisahan dengan kromatografi ekslusi ditampung dalam vial yang telah diberi nomor. Fraksi-fraksi hasil kolom kromatografi ekslusi diuji KLT untuk mengetahui fraksi-fraksi mana saja yang memiliki harga Rf yang sama.

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan salah satu teknik pemisahan campuran secara modern. Dalam HPLC, zat cair digunakan sebagai fase gerak. Sebagai akibatnya zat cair akan sulit mengalir melewati kolom. Oleh karena itu dibutuhkan bantuan pompa bertekanan tinggi.

Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut, dengan bantuan pompa fase gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam fase gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fase diam. Solut yang kurang kuat interaksinya akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya, solut yang kuat berinteraksi akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatrogram menyatakan jumlah komponen sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC (Hendrayana, 2006).