Metode uji sitotoksik MTT

Metode uji sitotoksik

Uji sitotoksik 3-(4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) merupakan metode kolorimetri, dimana pereaksi MTT ini merupakan garam tetrazolium yang dapat dipecah menjadi kristal formazan oleh sistem suksinat tetrazolium reduktase yang terdapat dalam jalur respirasi sel pada mitokondria yang aktif pada sel yang masih hidup. Kristal formazon ini memberi warna ungu yang dapat dibaca  absorbansinya dengan menggunakan Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) reader (Pamilih, 2009).  Penetapan jumlah sel yang bertahan hidup pada uji sitotoksik dapat dilakukan berdasarkan dengan adanya kerusakan membran meliputi perhitungan sel yang mengambil (up take) atau dengan bahan pewarna seperti biru tripan. Sedangkan perubahan morfologi diketahui dengan mikroskop elektron.

Uji sitotoksik digunakan untuk menentukan parameter nilai IC₅₀. Nilai IC₅₀ menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel sebesar 50% dan menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel. Nilai ini merupakan patokan untuk melakukan uji pengamatan kinetika sel. Nilai IC₅₀ dapat menunjukkan potensi suatu senyawa sebagai sitotoksik. Semakin besar harga IC₅₀ maka senyawa tersebut semakin tidak toksik. Akhir dari uji sitotoksik dapat memberikan informasi % sel yang mampu bertahan hidup, sedangkan pada organ target memberikan informasi langsung tentang perubahan yang terjadi pada fungsi sel secara spesifik.

 Prinsip reaksi 3-(4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) menurut Mosmann (1983) sebagai berikut:

Uji Anti kanker

Uji sitotoksik terhadap kanker dengan metode MTT dilakukan dengan cara: Sel kanker dengan konsentrasi 3 x 10³ sel/100 μL didistribusikan kedalam sumuran dan diinkubasi selama 24 jam didalam inkubator CO₂ agar sel beradaptasi dan menempel di sumuran. Selanjutnya pada tiap sumuran ditambahkan 100 μL media kultur (MK) yang mengandung sampel dengan variasi kadar dan diinkubasi kembali selama 48 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang dan dicuci dengan 100 μL PBS (phosphate Buffered saline). Kemudian kedalam asing-masing sumuran ditambahkan 100 μL media kultur yang mengandung MTT dan diinkubasi kembali selama 4 jam pada suhu 37⁰ C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk formazan yang berwarna ungu. Setelah 4 jam, pada tiap sumuran ditambahkan reagen stopper untuk membunuh sel dan melarutkan kristal formazan. Plate di shaker selama 10 menit kemudian diinkubasi pada suhu kamar dalam ruang gelap selama semalam. Selanjutnya, absorbansi tiap sumuran dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.