Analisis skrining fitokimia

Uji alkaloid.

Uji  Alkaloid  dilakukan  dengan  metode  Mayer,Wagner  dan  Dragendorff.  Sampel  sebanyak  3  mL  diletakkan  dalam  cawan  porselin  kemudian ditambahkan 5 mL HCl 2 M  , diaduk dan  kemudian  didinginkan  pada  temperatur  ruangan.  Setelah sampel dingin ditambahkan 0,5 g NaCl  lalu  diaduk  dan  disaring.  Filtrat  yang  diperoleh  ditambahkan HCl 2 M sebanyak 3  tetes  , kemudian  dipisahkan menjadi  4  bagian  A,  B,  C,  D.  Filtrat  A  sebagai blangko,  filtrat B ditambah pereaksi Mayer,  filtrat  C  ditambah  pereaksi  Wagner,  sedangkan  filtrat  D  digunakan  untuk  uji  penegasan.  Apabila  terbentuk  endapan  pada  penambahan  pereaksi  Mayer  dan Wagner maka  identifikasi menunjukkan  adanya  alkaloid.  Uji  penegasan  dilakukan  dengan  menambahkan  amonia  25%  pada  filtrat  D  hingga  PH  8-9.  Kemudian  ditambahkan  kloroform,  dan  diuapkan  diatas  waterbath.  Selanjutnya  ditambahkan HCl 2M, diaduk dan disaring. Filtratnya  dibagi menjadi 3 bagian. Filtrat A  sebagai blangko,  filtrat  B  diuji  dengan  pereaksi  Mayer,  sedangkan  filtrat  C  diuji  dengan  pereaksi  Dragendorff.  Terbentuknya  endapan  menunjukkan  adanya  alkaloid. 

Uji tanin dan polifenol.

Sebanyak 3 mL sampel  diekstraksi  akuades  panas  kemudian  didinginkan.  Setelah  itu  ditambahkan  5  tetes  NaCl  10%  dan  disaring. Filtrat dibagi 3 bagian A, B, dan C. Filtrat A  digunakan  sebagai  blangko,  ke  dalam  filtrat  B  ditambahkan  3  tetes  pereaksi  FeCl3,  dan  ke  dalam  filtrat C ditambah garam gelatin. Kemudian diamati  perubahan yang terjadi.  

Uji saponin.

Uji  Saponin  dilakukan  dengan  metode Forth yaitu dengan cara memasukkan 2 mL  sampel  kedalam  tabung  reaksi  kemudian  ditambahkan 10 mL akuades lalu dikocok selama 30  detik,  diamati  perubahan  yang  terjadi.  Apabila  terbentuk  busa  yang mantap  (tidak  hilang  selama  30  detik)  maka  identifikasi  menunjukkan  adanya  saponin.  Uji  penegasan  saponin  dilakukan  dengan  menguapkan  sampel  sampai  kering  kemudian  mencucinya  dengan  heksana  sampai  filtrat  jernih.  Residu  yang  tertinggal  ditambahkan  kloroform,  diaduk  5  menit,  kemudian  ditambahkan  Na2SO4  anhidrat dan disaring. Filtrat dibagi menjadi menjadi  2 bagian, A dan B. Filtrat A sebagai blangko,  filtrat  B  ditetesi  anhidrat  asetat,  diaduk  perlahan,  kemudian  ditambah  H2SO4  pekat  dan  diaduk  kembali.  Terbentuknya  cincin merah  sampai  coklat  menunjukkan adanya saponin. 

Uji Kardenolin dan bufadienol.

Uji Kardenolin  dan  Bufadienol  menggunakan  3  metode  yaitu  metode  Keller  Killiani,  metode  Liebeman-Burchard  dan metode Kedde.  (i) Metode Keller-Killiani yaitu dengan menguapkan  2 mL sampel, dan mencucinya dengan heksana  sampai  heksana  jernih.  Residu  yang  tertinggal  dipanaskan  diatas  penangas  air  kemudian  ditambahkan  3  mL  pereaksi  FeCl3  dan  1  mL  H2SO4  pekat.  Jika  terlihat  cincin  merah  bata  menjadi  biru  atau  ungu  maka  identifikasi  menunjukkan  adanya  kardenolin  dan  bufadienol.  (ii) Metode  Lieberman-Burchard  yaitu  dengan  cara  menguapkan  sampel  sampai  kering.  Kemudian  ditambahkan  kedalamnya  10  mL  heksana,  diaduk  selama  beberapa  menit  lalu  biarkan.  Selanjutnya  diuapkan  diatas  penangas  air  dan  ditambahkan 0,1 g Na2S04 anhidrat lalu diaduk.  Larutan  disaring  sehingga  diperoleh  filtrat.  Kemudian filtrat dipisahkan menjadi 2 bagian, A  dan  B.  Filtrat  A  sebagai  blangko  dan  filtrat  B  ditambahkan  3  tetes  pereaksi  asam  asetat  glasial  dan  H2SO4,  senyawa  kardenolin  dan  bufadienol  akan  menunjukkan  warna  merah  sampai ungu.  (iii) Metode  Kedde  yaitu  dengan  cara  menguapkan  sampel  sampai kering kemudian menambahkan  2 mL kloroform, lalu dikocok dan disaring. Filtrat  dibagi  menjadi  2  bagian,  A  dan  B.  Filtrat  A  sebagai blangko, dan  filtrat B ditambah 4  tetes  reagen  Kedde.  Senyawa  kardenolin  dan  bufadienol akan menunjukkan warna ungu 

Uji flavonoid.

Sebanyak 3 mL sampel diuapkan,  dicuci  dengan  heksana  sampai  jernih.  Residu  dilarutkan  dalam  20 mL  etanol  kemudian  disaring.  Filtrat dibagi 4 bagian A, B, dan C. Filtrat A sebagai  blangko,  filtrat  B  ditambahkan  0,5  mL  HCl  pekat  kemudian  dipanaskan  pada  penangas  air,  jika  terjadi  perubahan  warna  merah  tua  sampai  ungu  menunjukkan  hasil  yang  positif  (metode  Bate  Smith-Metchalf).  Filtrat C  ditambahkan  0,5 mL HCl  dan  logam Mg  kemudian  diamati  perubahan warna  yang  terjadi  (metode  Wilstater).  Warna  merah  sampai jingga diberikan oleh senyawa flavon, warna  merah  tua  diberikan  oleh  flavonol  atau  flavonon,  warna hijau sampai biru diberikan oleh aglikon atau  glikosida. Filtrat D digunakan untuk uji KLT. 

Uji antrakuinon.

Uji  antrakuinon  dilakukan  dengan  uji  Brontrager  dan  uji  Brontrager  termodifikasi. Uji Brontrager dilakukan dengan cara  melarutkan  2  mL  sampel  dengan  10  mL  akuades  kemudian  disaring,  filtrat  diekstrak  dengan  5  mL  benzena. Hasil  ekstrak  dibagi menjadi  2  bagian,  A  dan B. Filrat A digunakan sebagai blangko dan filtrat  B  ditambahkan  5 mL  ammonia  kemudian  dikocok,  bila terdapat warna merah berarti hasil positif.  Uji  Brontrager  termodifikasi  dilakukan  dengan  melarutkan 2 mL sampel dengan 10 mL 0,5 N KOH  dan  1  mL  larutan  hidrogen  peroksida.  Kemudian  dipanaskan  pada waterbath  selama 10 menit, didi- nginkan  dan  disaring.  Pada  filtratnya  ditambahkan  asam  asetat  bertetes-tetes  sampai  pada  kertas  lakmus  menunjukkan  asam.  Selanjutnya  diekstrak  dengan 5 mL benzena. Hasil ekstrak dibagi menjadi  2  bagian,  A  dan  B.  Larutan  A  digunakan  sebagai  blangko,  sedangkan  larutan  B  dibuat  basa  dengan  2-5  mL  larutan  amonia.  Perubahan  warna  pada  lapisan  basa  diamati.  Warna  merah  atau  merah  muda menunjukkan adanya antrakuinon.

Analisis kromatografi lapis tipis (KLT)

 Uji alkaloid. 

Filtrat  D  pada  skrining  fitokimia  ditambah  amonia  25%  hingga  PH  8-9.  Kemudian  ditambahkan  kloroform, dan dipekatkan diatas  waterbath.  Fase  kloroform  ditotolkan  pada  plat  silika  gel  G60.  Elusi  dilakukan  dengan  metanol  : NH4OH pekat = 200  :  3.  Plat  dikeringkan  dan  diamati  pada cahaya tampak, UV 254 nm  dan  366  nm.  Kemudian  plat  disemprot  dengan  pereaksi  Dragendorff,  dikeringkan  dan  diamati pada cahaya tampak, UV  254 nm dan 366 nm. 

Uji saponin.

Sampel  ditambah  dengan  HCl  2M,  diaduk,  direfluks  6  jam  diatas  waterbath,  kemudian  didinginkan.  Setelah  itu  dinetralkan  dengan  amonia,  diuapkan  diatas  waterbath,  ditambah  n-heksana  kemudian  disaring.  Filtratnya  kemudian  diuapkan  diatas  waterbath,  ditambah 5  tetes  kloroform,  dan  ditotolkan  pada  plat  silika  gel  G60.  Elusi  dilakukan  dengan  kloroform  :  aseton = 4  : 1.  Plat  dikeringkan  dan  diamati  pada  cahaya  tampak, UV 254 nm dan  366  nm.  Kemudian  plat  disemprot  dengan  SbCl3  dioven  pada  suhu  110oC  selama  10  menit,  dan  diamati  pada cahaya tampak, UV 254 nm dan 366 nm. 

Uji kardenolin/bufadienol.

Sampel  ditotolkan  pada plat silika gel G60. Dielusi menggunakan CHCl3  : MeOH  =  1:1.  Plat  dikeringkan  dan  diamati  pada  cahaya  tampak,  UV  254  nm  dan  366  nm.  Selanjutnya  disemprot  dengan  pereaksi  kedde,  dikeringkan  di  udara,  dan  diamati  pada  cahaya  tampak, UV 254 nm dan 366 nm. Noda biru sampai  ungu mengindikasikan adanya lakton tak jenuh. 

Uji flavonoid.

Filtrat  C  pada  skrining  fitokimia  ditotolkan  pada  plat  silika  gel  G60.  Dielusi  dengan  butanol  :  asam  asetat  :  air  =  3:1:1,  kemudian  dikeringkan  dan  diamati  pada  cahaya  tampak,  UV  254  nm  dan  366  nm.  Selanjutnya  plat  disemprot  dengan  amonia,  dikeringkan  dan  diamati  kembali  pada cahaya tampak, UV 254 nm dan 366 nm.