Size exclusion chromatography (SEC) disebut juga gel permeation chromatography (GPC), gel filtration chromatography (GFC), merupakan metode kromatografi yang menggunakan partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang berbeda. Teknik SEC pertama kali ditemukan oleh Grant Henry Lathe dan Colin R Ruthven.
SEC umumnya diaplikasikan untuk kompleks makromolekuler sperti protein dan industri polimer terutama digunakan untuk memisahkan molekul biologis, untuk menentukan bobot molekul dan distribusi bobot molekul dari polimer. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat memasuki partikel dan mempunyai jalur dan waktu transit yang lebih panjang dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Semua molekul yang lebih besar dari ukuran pori tidak tertahan dan terelusi bersama. Molekul yang memasuki pori akan mempunyai waktu tinggal dalam partikel yang tergantung pada ukuran dan bentuk molekul. Molekul yang berbeda mempunyai waktu transit yang berbeda untuk melewati kolom.
Kelebihan SEC :
• Waktu pemisahan yang cepat dan hasil yang baik.
• Frekuensi tajam dan sensitivitas baik.
• Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak berinteraksi dengan fase stasioner.
• Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa menganggu proses filtrasi
Kekurangan SEC :
• Hanya sejumlah frekuensi terbatas dapat diakomodasi karena skala waktu kromatogram pendek.
• Tidak dapat digunakan untuk sampel dengan ukuran seragam, seperti isomer.
Teori
Kolom SEC mengandung partikel berpori dengan diameter pori yang berbeda. Linarut yang disuntikkan ke dalam kolom tersebut berdifusi ke dalam pori yang diameternya lebih besar daripada diameter efektif linarut. Walaupun bobot molekulnya sama, diameter efektifnya berbeda, dan komponen yang diameternya paling besar akan terelusi lebih dahulu. Dengan bertambah besarnya diameter linarut, jumlah pori yang dapat dimasuki dan kemampuannya berdifusi dalam pori menurun. Jadi, jika linarut berdiameter sedemikian rupa sehingga tidak dapat berdifusi ke dalam pori yang mana pun, maka linarut tersebut dikatakan tereksklusi sempurna dan tidak tertahan, artinya linarut tersebut terelusi dalam volume kolom. Linarut yang mampu berdifusi sempurna ke dalam semua pori dikatakan bermeasi sempurna ke dalam kemasan. Linarut jenis ini memerlukan volume pelarut yang jauh lebih besar untuk mengelusinya dari kolom.
Mekanisme SEC
Buffer dipompa melewati kolom oleh alat yang diatur oleh komputer. Saat campuran molekul dan ion-ion yang terlarut dalam pelarut diaplikasikan pada ujung atas kolom, molekul-molekul yang lebih kecil (dan ion) didistribusikan melalui volume pelarut yang lebih besar daripada yang tersedia unutk molekul besar. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat masuk ke dalam partikel dan karenanya memiliki jalur yang lebih panjang serta waktu transit yang lebih panjang dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Seluruh molekul yang lebih besar ukurannya dibandingkan ukuran yang tidak tertahan dan akan dielusi bersamaan. Molekul yang dapat masuk ke dalam pori akan memiliki waktu tinggal rata-rata dalam partikel, yang bergantung dari bentuk serta ukuran molekulnya. Karena itu, molekul besar bergerak lebih cepat melewati kolom, dan dengan inilah campuran tersebut dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya.
Prinsip SEC
Prinsip dari kromatografi eksklusi adalah terjadinya pemisahan molekul polimer sesuai dengan volume hidrodinamiknya ketika sampel diinjeksikan ke dalam kolom. Volume hidrodinamik yang dihasilkan dari system kromatografi ini terbagi menjadi tiga macam volume, yaitu:
•Volume interstisial (Vi) merupakan volume elusi yang diperoleh jika molekul polimer memiliki ukuran yang lebih besar daripada ukuran pori-pori sehingga tidak mampu masuk ke pori-pori.
•Volume interstisial dan Volume pori (Vi + Vp) merupakan volume elusi yang diperoleh jika molekul polimer memiliki ukuran yang lebih kecil daripada ukuran pori-pori sehingga mampu melewati dan masuk ke dalam pori-pori.
•Volume elusi (Ve) merupakan volume pori untuk molekul polimer yang memiliki ukuran diantara kedua molekul polimer sebelumnya. Untuk volume ini, dapat dirumuskan dengan persamaan: Ve = Vi + Ksec.Vp
Dimana Ksec adalah nilai konstan pada kromatografi eksklusi (0 < Ksec < 1)
Peralatan penting yang biasanya digunakan pada kromatografi eksklusi (size exclusion chromatography), antara lain pompa untuk mempertahankan aliran yang konstan, kolom dengan jenis molekul tertentu, dan detektor untuk hasil yang kuantitatif.
Berikut adalah skematis dari system kromatografi eksklusi.
Komponen yang digunakan pada sistem kromatografi ini, yaitu:
a. Kolom
Memilih Kolom
Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul linarut yang akan dipisahkan. Sampel yang ukurannya (bobot molekul) bermacam-macam tidak mampu dipisahkan jenis-jenis molekulnya jika digunakan satu ukuran pori-pori dari kolom.
Setiap kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu kurva kalibrasi tertentu. Batas eksklusi dan rentang kerja BM tidak didefinisikan dengan tajam karena distribusi pori kolom tidak sempit. Jika distribusi pori lebar maka akan dihasilkan kurva dengan kemiringan yang tajam. Dengan demikian, senyawa-senyawa yang memiliki ukuran molekul hampir sama akan dihasilkan daya pisah yang rendah jika rentang kerja BM-nya besar. Sebaliknya, jika distribusinya sempit maka akan didapat kurva yang lebih mendatar. Sehingga, rentang kerja BM akan menjadi lebih kecil tetapi daya pisah molekul yang memiliki ukuran hampir sama akan meningkat. Pemisahan optimum komponen-komponen suatu senyawa sampel yang memiliki distribusi bobot molekul lebar dapat diperoleh jika kolom eksklusi memiliki rentang kerja BM yang berbeda. Pada setiap rangkaian kolom dapat dihasilkan kurva kalibrasi tersendiri dimana perolehan kurva kalibrasi ini didapat dengan menyuntikkan senyawa baku (standar baku) yang diketahui bobot molekulnya, kemudian menentukkan VR masing-masing. Dengan demikian, kromatografi eksklusi merupakan suatu metode cepat yang dapat digunakan untuk memperoleh perkiraan harga bobot molekul (BM) suatu sampel dengan membandingkan empirisnya pada senyawa standar baku. Untuk memperoleh nilai perbandingan yang bagus, struktur antara sampel dengan senyawa standar baku haruslah sama.
b. Fase Gerak
Fase gerak dalam SEC harus merupakan pelarut polimer yang baik untuk menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang sesuai dan bertahan cukup lama sebelum akhirnya disuntikkan. Hal tersebut bertujuan agar pelipatan dapat mengembang dalam fase gerak atau dengan kata lain memecahkan agregat. Bila sampel hanya terlarut sebagian dalam fase gerak, maka dapat terjadi peningkatan tekanan pada kolom karena ukuran partikel yang terlalu besar. Efek tersebut dapat diatasi dengan cara memilih pelarut lain, atau meningkatkan temperatur kolom.
Pada beberapa kondisi, perlu adanya penambahan elektrolit agar terjadi disagregasi. Beberapa polimer, seperti polyolefin, biasa digunakan untuk analisis pada suhu tinggi (140-1500C). Bila analisis dilakukan pada kondisi tersebut, maka fase gerak yang bersifat toksik tidak dapat digunakan (contoh: triklorobenzen), sehingga perlu dipilih fase gerak yang lain. Fase gerak dalam SEC terbagi menjadi dua bagian besar, yaitu:
1.Fase gerak SEC untuk protein dan polimer larut air
SEC sering digunakan untuk mengisolasi protein, menghilangkan agregat, desalting sampel protein, memisahkan fraksi asam nukleat, atau untuk mengetahui sifat polimer larut air yang digunakan dalam makanan, cat, sediaan farmasi, dan sebagainya. Fase gerak yang digunakan disesuaikan dengan fase diam, antara lain:
1. Silika
Jenis kolom:SW,S WxI, danSuperSW digunakan untuk menganalisis protein dan asam nukleat menggunakan aqueous buffer sebagai fase gerak.
2. Polimetakrilat
Jenis kolom:PW danPWxI digunakan untuk menganalisis polimer industry, oligosakarida, asam nukleatm virus menggunakan fase gerak berupa larutan buffer atau larutan garam. Kolom PWxI yang digunakan untuk menganalisis polimer kationik menggunakan fase gerak berupa larutan garam encer.
Contoh pelarut mengandung air yang sering digunakan sebagai fase gerak dalam SEC yaitu buffer fosfat (pH 7,0), larutan KCl dan larutan NaCl
2.Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut organik.
Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut organik SEC sering digunakan untuk mengetahui sifat polimer organic polar dan polimer larut dalam pelarut organik. Pemilihan pelarut organic didasarkan atas efek partisi dan adsorpsi pelarut. Jenis fase gerak yang digunakan disesuaikan dengan fase diam, antara lain:
1. Polimetakrilat (high % X-linking)
Jenis kolom:Alpha danSuperAW menggunakan fse gerak berupa pelarut organic polar seperti methanol, asetonitril, DMF, DMSO, THF, dan HFIP.
2. Polistirena
Ada dua jenis kolom, yaitu kolom Ultra-low adsorption (contoh:SuperHZ, SuperMultiporeHZ, HxIdan Multipore) menggunakan pelarut yang terbatas, dan kolom Low adsorption (contoh:SuperH danHhr) dapat menggunakan pelarut yang lebih bervariasi.
c. Detektor
Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan sistem detektor yang berbeda-beda, misalnya dengan refraktometer atau detektor UV-Vis. Intensitas detektor direkam sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem dikaliberasi dengan menggunakan polimer sampel yang diketahui berat molekulnya, dapat dilakukan dengan evaluasi berat molekul dan distribusi berat molekul menggunakan detektor sinar menyebar (light scatter detector), berat molekul polimer dapat ditentukan secara langsung dan tidak perlu dikaliberasi terlebih dahulu. Peralatan SEC
Gambar 6. Size exclusion chromatography (german: GPC) Calibration versus PS- Standards, solvent normally THF, Mw range 600- 3000000 g/mol
2. Teknik menggunakan size exclusion chromatography (SEC) dengan on-line light-scattering, UV absorbance, dan refractive index detectors untuk karakterisasi berat molekul polipeptida dari simple protein atau glikoprotein atau untuk menentukan stoikiometri dari kompleks protein. Dua keuntungan dari pendekatan ini adalah pengukuran berat molekul tidak bergantung pada posisi elusi dan dapat meniadakan pengaruh karbohidrat. Ketika sebuah protein atau kompleks berisi tanpa karbohidrat, metode 2 deteksi yaitu: light scattering dikombinasi dengan refractive index dapat digunakan untuk menghitung berat molekul. Ketika protein mengandung karbohidrat metode 3 detektor digunakan untuk menghitung berat molekul dari polipeptida sendiri. Pada akhirnya, metode tiga detektor digunakan untuk menentukan stoikiometri kompleks protein yang mengandung karbohidrat
DAFTAR PUSTAKA
Wen Jie, Tsutomu Arakawa, and John S. Philo. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY:
Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbanc
and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions.
Protein Chemistry Department, Amgen Inc., Thousand Oaks, California. 1996
Chi-san Wu. Handbook of Size Exclusion Chromatography. MARCEL DEKKER,
INC. New York. 1995
http://www.polymer.uni-karlsruhe.de/english/310.php
http://www.impactanalytical.com/applications/sec.aspx
http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/size-exc.htm
http://www.kfunigraz.ac.at/~trathnig/2032-_a.pdf
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/Siz
eExclusion/
Tidak ada komentar:
Posting Komentar