Uji Aktivitas Antioksidan
Metode pengujian aktivitas antioksidan dikelompokkan
menjadi 3 golongan. Golongan pertama adalah Hydrogen Atom Transfer Methods (HAT),
misalnya Oxygen Radical Absorbance Capacity Method (ORAC) dan Lipid
Peroxidation Inhibition Capacity Assay (LPIC). Golongan kedua adalah Electron
Transfer Methods (ET), misalnya Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP)
dan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH) Free
Radical Scavenging Assay. Golongan ketiga adalah metode lain
seperti Total Oxidant Scavenging Capacity (TOSC) dan Chemiluminescence
(Badarinath et al., 2010). Salah satu metode yang paling umum
digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan adalah dengan menggunakan radikal
bebas 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazil (DPPH). Pengukuran antioksidan
dengan metode DPPH merupakan metode pengukuran antioksidan yang sederhana,
cepat dan tidak membutuhkan banyak reagen seperti
halnya metode lain. Hasil pengukuran dengan
metode DPPH menunjukkan kemampuan antioksidan sampel secara umum, tidak
berdasar jenis radikal yang dihambat (Juniarti et al., 2009).
Pada metode lain selain DPPH membutuhkan reagen kimia
yang cukup banyak, waktu analisis yang lama, biaya yang mahal dan tidak selalu
dapat diaplikasikan pada semua sampel (Badarinath et al., 2010). Pada
metode ini, larutan DPPH berperan sebagai radikal bebas yang akan bereaksi
dengan senyawa antioksidan sehingga DPPH akan berubah menjadi 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazin
yang bersifat non-radikal. Peningkatan jumlah 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazin
akan ditandai dengan berubahnya warna ungu tua menjadi warna merah muda
atau kuning pucat dan dapat diamati menggunakan spektrofotometer sehingga
aktivitas peredaman radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan (Molyneux,
2004).
Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
menggunakan prinsip spektrofotometri. Senyawa DPPH dalam metanol berwarna ungu
tua terdeteksi pada panjang gelombang sinar tampak sekitar 515-517 nm.
Parameter untuk menginterpretasikan hasil pengujian
DPPH adalah dengan nilai IC50 (Inhibitor
Concentration). IC50 merupakan
konsentrasi larutan substrat atau sampel yang mampu mereduksi
aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin kecil nilai IC50 berarti semakin
tinggi aktivitas antioksidan. Secara spesifik suatu senyawa dikatakan sebagai
antioksidan sangat kuat jika nilai IC < 50 ppm),
kuat (50 ppm < IC lemah (150 ppm < IC
50 50 50 kurang dari 50 ppm (IC < 100 ppm), sedang
(100 ppm < IC < 200 ppm), dan sangat
lemah (IC 50 < 150 ppm), > 200 ppm). Strukur DPPH radikal bebas
dan DPPH yang telah bereaksi dengan antioksidan (Molyneux, 2004).
Uji DPPH yang
digunakan untuk pengukuran total aktivitas antioksidan ini adalah
memodifikasi dari metode Zhang. Y et al.,(2010). Sebanyak 80 μl larutan DPPH dimasukan ke
dalam 96 well microplate yang di dalamnya telah terdapat 50 μl ekstrak. Untuk kontrol, campuran berisi 80 μl larutan DPPH dan 50 μl metanol.
Campuran diinkubasi selama 30 menit di tempat gelap pada temperatur
ruang.
Uji Aktivitas Antioksidan
Radikal bebas yang
digunakan adalah 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH).Daya peredaman radikal
bebas dilakukan dengan menghitung nilai EC50 (efficient concentration) atau disebut nilai IC50 (inhibition corelation), yakni
konsentrasi yang menyebabkan hilangnya 50% aktivitas DPPH. Penetapan daya
peredaman radikal bebas manggunakan larutan standar adalah larutan DPPH dalam
metanol. Larutan uji adalah campuran larutan DPPH dalam metanol dengan sampel
yang konsentrasinya telah diketahui. Diukur penurunan intensitas serapan pada λ 516-517 nm.
Senyawa
1,1–Difenil-2-Pikril Hidrazil (DPPH) dengan rumus molekul C18H12N5O6
adalah radikal bebas yang stabil, berwarna ungu dan berupa kristal berbentuk
prisma. Karena bersifat stabil apabila digunakan sebagai pereaksi dalam uji
peredaman radikal bebas tidak perlu dibuat segar dan senyawa ini jika disimpan
dalam kondisi penyimpanan yang baik tetap stabil selama bertahun-tahun.
Peredaman warna DPPH terjadi karena adanya senyawa yang dapat memberikan
radikal hidrogen kepada radikal DPPH sehingga tereduksi menjadi DPPH-H
(1,1-difenil-2-pikrilhidrazin).
Uji aktivitas
antioksidan dilakukan dengan menggunakan microplate reader two fold dilution
dengan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) yang diukur pada panjang gelombang 520 nm (Zhang, et al,. 2006) masing-masing sebanyak 2 mg ekstak nhexan,etil asetat, metanol kulit buah
kelengkeng dilarutkan dalam 2 ml MeOH (1000 µg/ml). Baris A dimasukkan sampel sebanyak 100 µl (plate
terdiri dari baris A-H masing-masing berjumlah 12 lubang). Sebanyak 50 µl MeOH dimasukkan pada masing-masing sumur pada baris B-F. Baris A dipipet
sebanyak 50 µl dan dimasukkan ke baris B, baris B dipipet 50 µl dimasukkan ke baris C dan
dilakukan sampai baris F, baris F dipipet 50 µl, lalu
dibuang, sehingga diperoleh konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62.5, dan 31.25 µg/ml. Sedangkan pada baris G-H
diisi dengan MeOH 100 µl, khusus pada baris H diisi hanya lubang 1-6. Baris A-G ditambahkan DPPH
sebanyak 80 µl dengan konsentrasi 40 µg/ml, kemudian diinkubasi selama 30 menit. Aktivitas radikal bebas diukur dengan penurunan absorbansi DPPH
dengan microplate reader dan dengan olah data. Kontrol positif yang digunakan
sebagai pembanding yaitu vitamin C dengan konsentrasi 50 µg/ml. Nilai % inhibisi dihitung dengan rumus sebagai berikut:
% Inhibisi = Abs.
Kontrol – Abs.sampel x 100%
Abs. Kontrol
Tidak ada komentar:
Posting Komentar