Pewarnaan Gram Bakteri

Bakteri

Sebagian besar bakteri memiliki diameter dengan ukuran 0,2-2,0 mm. Biasanya sel-sel bakteri yang muda berukuran jauh lebih besar daripada sel-sel yang tua. Bentuk dan ukuran suatu bakteri dapat dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti temperatur inkubasi, umur kultur, dan komposisi media pertumbuhan (Pratiwi, 2008).

Spesies bakteri dapat dibedakan berdasarkan morfologi (bentuk), komposisi kimia (umumnya dideteksi dengan reaksi biokimia), kebutuhan nutrisi, aktivitas biokimia, dan sumber energi (sinar matahari atau bahan kimia). Ada beberapa bentuk dasar bakteri, yaitu bulat (tunggal: coccus, jamak: cocci), batang atau silinder (tunggal: bacillus, jamak: bacilli), dan spiral yaitu berbentuk batang melengkung atau melingkar-lingkar (Pratiwi, 2008).

Beberapa bakteri memiliki endospora, yaitu struktur dengan dinding tebal dan lapisan tambahan pada sel bakteri yang dibentuk di sebelah dalam membrane sel. Endospora berfungsi sebagai pertahanan sel bakteri terhadap panas ekstrim, kondisi kurang air, dan paparan bahan kimia serta radiasi. Struktur endospora terdiri atas inti (core), korteks, dan selubung (coat). Salah satu karakteristik endospora bakteri adalah susunan kimianya, yaitu mengandung sejumlah besar asam dipikolinat, yang mencapai 5-10% berat kering endospora. Hanya dua genus bakteri dengan kemampuan membentuk struktur khusus berupa endospora yang penting dalam dunia kesehatan yaitu Bacillus dan Clostridium yang bersifat Gram positif (Pratiwi, 2008).

Pewarnaan Gram 

Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Bakteri terwarnai adalah organisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Metode pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut juga teknik pewarnaan diferensial (Volk dan Wheeler, 1993). Pewarnaan diferensial yang sering digunakan adalah pewarnaan Gram, yang diciptakan oleh Hans Christian Gram pada tahun 1884. Pewarnaan Gram ini mampu membedaan dua kelompok besar bakteri, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Pada saat teknik pewarnaan Gram, bakteri yang berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam Gram negatif (Deviani, 2014).

Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding sel bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangan dinding sel bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida (Deviani, 2014).

Bakteri Gram negatif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase lebih tinggi daripada yang dikandung bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram negatif juga lebih tipis daripada dinding sel bakteri Gram positif. Bukti-bukti percobaan membuktikan bahwa selama prosedur pewarnaan, perlakuan dengan etanol terhadap bakteri Gram negatif menyebabkan terekstrasinya lipid sehingga memperbesar daya rembes atau permeabelitas dinding sel Gram negatif. Kompleks kristal ungu-iodium yang telah memasuki dinding sel selama langah awal dalam proses pewarnaan dapat diekstraksi, oleh sebab itu organism Gram negatif kehilangan warna tersebut. Kandungan lipidnya yang rendah, membuat dinding sel bakteri Gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol. Ukuran pori-pori mengecil, permeabilitas berkurang, dan komples ungu kristal-iodium tidak dapat terekstraksi (Pelezar dan Chan, 2006). 

2.Uji Biokimia

Uji biokimia merupakan salah uji yang digunakan untuk menentukan spesies bakteri yang tidak diketahui sebelumnya. Setiap kuman memiliki sifat biokimia yang berbeda sehingga tahapan uji biokimia ini sangat membantu proses identifikasi. Setelah sampel diinokulasikan pada media diferensial atau selektif, kemudian koloni kuman diinokulasikan pada media uji biokimia. Ada 12 jenis uji yang sering digunakan dalam uji biokimia walaupun sebenarnya masih banyak lagi media yang dapat digunakan. Pada penelitian ini digunakan 4 uji yaitu, uji TSIA, uji LIA, uji KIA, dan uji motilitas.

Uji TSIA

Uji biokimia salah satunya uji TSIA, menggunakan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan enterobactericeae untuk memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam karbohidrat yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Indikatornya adalah phenol red yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. Selain menggunakan media TSIA dapat pula digunakan media KIA (Kligers Iron Agar), bedanya adalah pada media KIA hanya berisi 2 macam karbohidrat yaitu glukosa dan laktosa. 

Media TSIA juga dapat digunakan untuk mengetahui pembentukan H₂S yaitu melihat apakah bakteri memfermentasi metionin dan sistein (asam amino yang mempunyai gugus S). Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika bakteri memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus S akan keluar dan gugus S akan bergabung dengan H₂O membentuk H₂S. Selanjutnya H₂S bergabung dengan Fe²⁺ membentuk FeS berwarna hitam dan mengendap (Haryani, 2012). Media TSIA mengandung komposisi sebagai berikut:

        Lab-Lemco powder 3,0 gr, sebagai sumber vitamin B bagi mikroorganisme

       Yeast extract 3,0 gr, sebagai sumber nitrogen

       Pepton 20,0 gr, sebagai sumber energi/nutrisi bagi mikroorganisme

      Natrium klorida 5,0 gr, sebagai pengatur keseimbangan tekanan osmosis/ bahan buffer media

      Laktosa 10,0 gr, sebagai sumber karbohidrat yang akan di fermentasikan oleh bakteri

      Sukrosa 10,0 gr, sebagai sumber karbohidrat yang akan di fermentasikan oleh bakteri

      Glukosa 10,0 gr, sebagai sumber karbohidrat yang akan di fermentasikan oleh bakteri

      Ferri amonium sitrat 0,3 gr, sebagai akseptor elektron yang dapat memperlihatkan pembentukan H₂S oleh bakteri dan juga sebagai bahan buffer

      Natrium thiosulfat 0,3 gr, sebagai sumber mineral dan energi bagi mikroorganisme

       Phenol red 0,5 gr, sebagai indikator

     Agar, sebagai bahan pemadat media dan tempat tumbuhnya mikroorganisme.

2.4.2. Uji Lysine Iron Agar (LIA)

Uji LIA adalah uji biokimia menggunakan media diferensial yaitu Lysine Iron Agar (LIA)dengan indikator pH yang dapat membedakan mikroorganisme berdasarkan kemampuannya dalam memecah karbohidrat spesifik dengan atau tanpa menghasilkan gas. Berdasarkan hal tersebut bakteri dapat digolongkan sebagai mikroba non fermenter, fermenter glukosa, atau fermenter glukosa dan laktosa (Haryani, 2012). LIA mengandung glukosa, asam amino lisin, dan brom kresol ungu sebagai pH indikator, serta natrium tiosulfat. LIA dapat digunakan untuk identifikasi mikroba penghasil enzim yang mampu mendekarboksilasi dan mendeaminasi asam amino lisin dan memproduksi gas H₂S (Sinaga, 2010). Dekarboksilasi adalah proses dimana organisme yang memiliki enzim dekarboksilase spesifik yang mampu menyerang asam amino pada gugus karboksil yang menghasilkan amin atau diamin dan CO_2. 

Lisin merupakan substrat yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan enzim dekarboksilase. Pada pengujian LIA terdapat 2 proses degradasi yaitu deaminasi lisin (reaksi aerobik) yang terjadi pada kemiringan media, serta dekarboksilasi lisin (reaksi anaerobik) yang terjadi pada ujung media. Jika organisme memiliki kemampuan dekarboksilasi lisin maka akan menghasilkan sebuah produk akhir amina yang bereaksi dengan indikator ph untuk memberikan warna ungu pada tabung. Jika organisme memiliki kemampuan deaminasi lisin, amonia yang dihasilkan akan bereaksi dengan ammonium sitrat besi untuk menghasilkan warna merah gelap pada kemiringan tabung. mikroorganisme yang menghasilkan gas H₂S akan menunjukkan endapan hitam di ujung tabung. Media yang digunakan mengandung komposisi sebagai berikut:

·         Pepton, sebagai sumber energi/nutrisi bagi mikroorganisme

·         Yeast extract, sebagai sumber nitrogen

·         Glukosa, sebagai sumber karbohidrat yang akan di fermentasikan oleh bakteri

·         Lisin monohidroklorida, sebagai sumber karbohidrat yang akan di fermentasikan oleh bakteri

·         Natrium thiosulfat, sebagai sumber mineral dan energi bagi mikroorganisme

·         Ferri amonium sitrat, sebagai akseptor elektron yang dapat memperlihatkan pembentukan H₂S oleh bakteri dan juga sebagai bahan buffer

·         Bromokresol ungu, sebagai indikator

·         Agar, sebagai bahan pemadat media dan tempat tumbuhnya mikroorganisme.

Uji Kliger Iron Agar (KIA)

Kliger Iron Agar (KIA) merupakan media diferensial untuk golongan Enterobacteria non fermentasi basil gram negatif lainnya. Media KIA mengandung glukosa, laktosa, phenol merah dan ferri sulfat. Hasil yang didapat pada uji KIA ini yaitu bagian dasar media menunjukkan bagian fermentasi glukosa, sedangkan bagian tebing menunjukkan bagian fermentasi laktosa. Gelembung udara dalam medium menunjukkan adanya pembentukan gas dari fermentasi glukosa. Warna hitam menunjukkan produksi H₂S oleh bakteri (Mac Faddin, 1980).

Kemampuan bakteri memfermentasikan dekstrosa dan laktosa serta kemampuan memproduksi H₂S merupakan dasar untuk mengetahui jenis bakteri tertentu dari pertumbuhannya dalam medium ini. Adapun sifat pertumbuhan bakteri pada KIA adalah sebagai berikut :

a) Lereng kuning, dasar kuning tanpa H2S

b) Lereng kuning, dasar kuning dengan H2S

c) Lereng merah, dasar kuning dengan H2S

d) Lereng merah, dasar kuning tanpa H2S

e) Lereng merah, dasar merah (tidak ada perubahan warna)

Perubahan pH karena adanya fermentasi glukosa atau laktosa mengahsilkan asam menyebabkan terjadinya warna kuning dengan adanya indikator phenol red. Uji ini menggunakan media KIA dengan komposisi sebagai berikut:

• Beef extrack 3 g, sebagai sumber energi/nutrisi bagi mikroorganisme
• Yeast extrack 3 g, sebagai sumber nitrogen
• Pepton 15 g, sebagai sumber energi/nutrisi bagi mikroorganisme
• Proteose pepton 5 g, sebagai sumber energi/nutrisi bagi mikroorganisme
• Laktosa 10 g, sebagai sumber karbohidrat yang akan di fermentasikan oleh bakteri
• Dekstrosa 1 g, sebagai sumber karbohidrat yang akan di fermentasikan oleh bakteri
• Ferro sulfat 0,2 g, sebagai akseptor elektron yang dapat memperlihatkan pembentukan H₂S oleh bakteri dan juga sebagai bahan buffer
• Natrium klorida 5 g, sebagai pengatur keseimbangan tekanan      osmosis/bahan buffer media
• Natrium thiosulfat 0,3 g, sebagai sumber mineral dan energi bagi mikroorganisme
• Phenol red 0,024 g, sebagai indikator
• Agar 12 g, sebagai bahan pemadat media dan tempat tumbuhnya mikroorganisme.

Uji Motilitas

Uji motilitas bertujuan untuk melihat pergerakan bakteri. Media yang dipakai adalah media yang bersifat semi solid dengan kandungan agar-agar 0,2-0,4%. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui gerak kuman, bisa memakai media MO (Motilitas Ornitin) atau SIM (Sulfida Indol Motility). Pada media SIM selain untuk melihat motilitas bisa juga untuk test indol dan pembentukan H₂S (Lamid et al., 2011). 

Hasil yang diperoleh pada uji ini adalah positif, hal ini terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagella. Dari uji juga terlihat ada warna hitam, yang berarti bakteri ini menghasilkan H₂S (Lamid et al., 2011). Pada penelitian ini untuk pengujian motilitas digunakan media SIM dengan komposisi media sebagai berikut:

·         Peptone from casein 20 g, sebagai sumber energi/nutrisi bagi mikroorganisme

·         Peptone from meat 6,6 g, sebagai sumber energi/nutrisi bagi mikroorganisme

·         Ferri amonium sitrat 0,2 g, sebagai akseptor elektron yang dapat memperlihatkan pembentukan H₂S oleh bakteri dan juga sebagai bahan buffer

·         Natrium thiosulfat 0,2 g, sebagai sumber mineral dan energi bagi mikroorganisme

·         Agar 3,0 g, sebagai bahan pemadat media dan tempat tumbuhnya mikroorganisme.