• Penggunaan biokimia, mikrobiologi dan keteknikan
kimia secara terpadu untuk menerapkan penanfaatan mikroba dan kultur jaringan.
• Spektrum bioteknologi sangat luas meliputi produksi
pangan terfermentasi, antibiotika, enzim, alkohol, pelarut organik, vitamin,
kultur sel, pengendalian limbah, pemurnian minyak, pengikatan nitrogen dll.
• Suatu ilmu terapan dengan biologi molekular
sebagai ilmu dasarnya
• Suatu interaksi biologi dengan teknologi,
melalui proses tranformasi biologis
Biologi molekuler
• Ilmu yang mempelajari seluk beluk struktur dan
fungsi molekul kimia yg terdapat dalam sistem hidup (manusia, hewan, tubular
dan mikroba)
• Bidang ini berkembang sangat pesat setelah
tersingkapnya tabir rahasia struktur kimia dna, yaitu suatu senywa pembwa
informasi sifat genetik. Mekanisme fungsi gen pada tingkat molekular merupakan
pokok bahasan biologi molekuler.
• Sampai awal 1940-an, ilmu pengtahuan belum
memiliki jawaban yg jelas tentang senyawa kimia apa yg berperan sebagai pembawa
sifat genetika (hub sifat genotipe dan fenotipe><non fisik buas, pemarah,
jinak, cerdas, periang, baik budi dll.
• Kita ketahui bahwa makhluk hidupdisusun oleh
senyawa utama yaitu makromolekul (prot, lipid, karbohidrat dan as nukleat)
• Thn 1944, o.t. avery, c. Macleod dan m. Mccarty
berhasil menjawab bahwa sifat genetik dibawa oleh dna bukan protein
• Kemudian diikuti oleh penemuan lainnya seperti
struktur dna oleh watson dan crick (double helix, setiap putaran 10nucletida
dng jarak 0,34nm)
• Sepotong untaian dna (‘gen’ ±1000pb) membewa
pesan genetik membntuk polipeptida, selanjutnya bergabung menjadi protein
(dogma sentral)
• Dogma sentral ada dua jalur yaitu sintesis
protein dan replikasi gen (regenerasi)
• Protein merupkan komponen utama sel hidup, dan
fungsi utamanya sebagai biokataisator dalam semua reaksi kimia di dalam sel
hidup ‘enzim’, otot, struktur penunjang spt rambut, kulit dll.
• Sehingga informasi genetik suatu sel genotipe
merupakan penentu sifat tampak luar ‘fenotipe’ (mutasi pada genetik akan
menyebabkan perubahan fenotipe/fungsi)~penyakit genetik ‘anemia, talesimia i,
15122011
Sel
• Sel adalah unit terkecil dari kehidupan, oleh
sebab itu memerlukan energi untuk melangsungkan berbagai proses metabolisme
(pertumbuhan, perbaikan dan reproduksi)
• Semua reksi kimia yang terjadi di dalam sel
dikatalisis oleh enzim
• Struktur setiap enzim (protein lainnya)
dikodekan oleh satu segmen dna yang disebut gen
• Berdasarkan sumber
karbon/ energinya, sel tebagi atas autotrof dan heterotrof, fototrof dan
chemotrof
• Glikolisis: proses
perubahan gula (glukosa) menjadi 2 molekul piruvat
• Setelah glikolisis:
bisa terjadi fermentasi atau respirasi
• Fermentasi: proses
tanpa o2, mengahsilkan asam atau alkohol
• Respirasi:
penguraian secara sempurna untuk menghasilkan energi (atp)
Ruang
lingkup & perkembangan
• Bioteknologi
• A. 1 mikrobiologi
& biokimia
• jumlah mikroba yang sudah
dimanfaatkan untuk
• Bioteknologi masih sedikit →→ perlu upaya :
• upaya tsb bertujuan untuk memperoleh mutan yg
• Memiliki sifat:
• efisen dalam proses
• dapat menggunakan bahan dasar yang
lebih bervariasi
• stabil selama proses dan dalam
stock
• Isolasi seleksi
• Strain
• Improvement
• Screening
2.
Fisiologi mikroba
studi hubungan
antara kemampuan
Metabolisme dengan lingkungan
dimana
Mikroba berada baik dalam keadaan
Tumbuh/tidak tumbuh
kemampuan memodifikasi sel:
struktur sel
kimia sel dan
faal sel
tujuan modifikasi :
Untuk menyebabkan
Metabolite over production
Agar dapat mengatasi feedback
regulation
Dieksploitasi
(optimasi kondisi
Lingkungan)
Produk
/kemampuan yg
Diinginkan
3.
Biokimia
sintesis :
metabolit primer
metabolit sekunder
enzim dan fungsi
kimia sel yang lain
katabolisme
xenobiotic chemicals → waste
Treatment
enzyme immobization
isolasi, pemurnian
molekul biologi &
Karakterisasi
B. Rekayasa genetik
berperan dalam strain
improvement
Isolasi wild
type mutagenesis
seleksi mutan
Fermentasi metabolit primer
-ferm alkohol, asam cuka, asama sitrat, aasam amino,
vitamin, enzim
Fermentasi metabolit sekunder
Mitotoksin,biopestisida,alakloid,pigmen, antibotik,
enzim
Sampel mikroorganisme
(dari limbah dll)
• Isolasi (streak palte) dengan media yg sesuai
• Identifikasi (makroskopis &mikroskopis/
genetika) 5012012
Mikroba
Uji aktivitas secara kuali dan
kuantitatif
Mikroba aktif
Produksi enzim
Isolasi,
seleksi, pemuliaan dan preservasi mikroba
• Mo kecil hanya dapat
dilihat dgn alat
• Oleh sebab itu
keterangan sifat-sifat hidup terbatas
• Pada umumnya yg
dipelajari populasi mo yg terdiri atas jutaan bahkan milyaran sel
• Populasi yg
ditumbuhkan dgn sengaja pada media dan kondisi tertentu disebut kultur
• Kultur ada yg murni
(aksenik), kultur dua anggota atau kultur campuran.
Mikroba aktif
• induksi substrat
• pengaturan komposisi medium
• Pengaturan parameter fisika
• Crude enzymes ektracellular
(fraksi 0-20% ; fraksi 20-40%
; fraksi 40-60% ; fraksi 60-80% ; fraksi 80-100%) (nh4)2so4
Fraksi aktif
• Kromatografi kolom gel filtrasi sephadex g75
• Kromatografi kolom penukar ion deae cellulose
1. Karakterisasi enzim
2. Elektroforesis (sds page)
Isolasi dan pemurnian enzim
• Ekstrak enzim kasar (intra / ekstra sel)
• Fraksionasi dengan amonium sulfat
• Dialisis
• Pemekatan
• Chromatografi (filtrasi gel, penukar ion,
afinitas, hplc dll)
• Uji kemurnian (elektroforesis)
• Penentuan parameter kinetika
Teknik isolasi dan pemurnian
enzim
Pemisahan ekstrak enzim kasar
(crude extrct)
- Pemecahan sel : (kimiawi/fisik)
- alkali (naoh), lisozim dan edta, detergen
-voter elvehjem (hand-operator or motordriven glass homogenizer (
-blender (food processor)
-ultrasonic probe
-vibrating glass bead mill
-dll (pendinginan mendadak/osmosis
2. Media ekstraksi: bufer yg
mendekati pka
3. Ektraselular enzim diambil
dari media
4. Fraksionasi dengan ammonium sulfat
-
solubilitas dlm air tinggi, tdk mengandung zat toksik terhadap enzim, murah,
bisa sebagai stabilisator enzim
-
teknik awal dalam proses
pemurnian enzim dan untuk pemekatan
-
Kelarutan
molekul protein di dalam suatu pelarut ditentukan oleh distribusi muatan grup
hidrofilik dan hidrofobik pada permukaan
-
‘salting
out’ effect tergantung kepada sifat-sifat hidrofobik dari protein.
-
Penambahan
garam akan mengikat molekul air yg ada pada protein dan akan membuka tapak
hidrofobik
-
Tapak
hidrofobik akan saling berinteraksi sehingga terjadi agregasi, namun untuk
menghidari denaturasi termal, maka harus dilakukan pada suhu dingin 0-5oc
Kromatografi kolom filtrasi
gel
• Memisahkan protein berdasarkan bobot molekul dan
ukuran molekul
• Seperti sepahdex (gel dektran) dan diberi kode g
dan angka dibelakannya menunjukan pengembangannya didalam air (g25 =
pengembangan 25 kali)
• Bila larutan protein dari berbagai ukuran
molekul dilewatkan ke dlam kolom filtrasi gel, maka molekul yg berukuran kecil
akan masuk kedalam pori gel dan keluar lebih lambat.
• Molekul berukuran lebih besar akan keluar lebih
cepat dan lewat diantara partikel gel.
• Memisahkan protein berdasarkan bobot molekul dan
ukuran molekul
• Seperti sepahdex (gel dektran) dan diberi kode g
dan angka dibelakannya menunjukan pengembangannya didalam air (g25 =
pengembangan 25 kali)
• Bila larutan protein dari berbagai ukuran
molekul dilewatkan ke dlam kolom filtrasi gel, maka molekul yg berukuran kecil
akan masuk kedalam pori gel dan keluar lebih lambat.
• Molekul berukuran lebih besar akan keluar lebih
cepat dan lewat diantara partikel gel.
Kromatografi kolom penukar ion
• Pemisahan terjadinya karena pertukaran ion
sejenis antara zat yg berbeda dalam fasa mobil dengan zat yg terikat pada fasa
stasioner.
• Dipengaruhi oleh kerapatan muatan, distribusi
muatan, dan ukuran komponan yg dipisahkan
• Matrik berupa material inert seperti polistiren,
divinil benzen atau polisakarida yang berikatan dngan molekul ion tertentu
(deae, cm dan asam sulfonat)
• Deae selulosa memberikan amino nitroge
• N pada ph 9 berikatan dengan molekul bermuatan
negatif (penukar anion) untuk protein yg stabil diatas pi
• Suatu protein bermuatan negatif dilewatkan ke
matrik deae selulosa maka protein tersebut akan terikat, apabila kedalam kolom
dialirkan garam, maka beberapa protein akan terlepas kembali sebanding dengan
pengikatan muatan ionik dari garam tersebut
Sds-page
• Elektroforesis adalah teknik pemisahan protein
berdasarkan bentuk, ukuran dan muatannya.
• Matrik yg sering digunakan adalah poli
akrilamida atau agarosa
• Elektroforesis sds dapat menganalisis protein
secara kualitatif dan kuantitatif
• Pada elektroforesis sds penambahan tiol akan
memutus ikatan disulfida pada protein dan akan berikatan dengan sds membentuk
muatan negatif
• Kecepatan migrasinya ditentukan oleh berat
molekul polipeptida-sds
• Dengan menggunakan protein standar maka akan
didapat berat molekulnya
Skema tahapan pemurnian enzim
|
Tahapan
|
Vol
(ml)
|
Akt
(u/ml)
|
Total
Akt
(u)
|
Kadar
Prot
(mg/ml)
|
Total
Prot
(mg)
|
Akt. Sp
(u/mg)
|
Perolehan kembali(%)
|
Faktor
Kemurnian (x)
|
|
Crude extract
|
725
|
1,10
|
890
|
0,56
|
406
|
1,99
|
‘100’
|
‘1,00’
|
|
F. Am. Sulfat
|
25
|
6,08
|
152
|
1,69
|
42,28
|
3,59
|
17,0
|
1,8
|
|
Krom. Filtrasi gel
|
30
|
8,83
|
134,7
|
1,35
|
17,6
|
20,66
|
15,1
|
10,38
|
|
Krom. Penukar ion
|
27
|
1,21
|
16,14
|
0,137
|
1,91
|
31,2
|
1,8
|
15,68
|
Karakterisasi enzim
• Ph optimu
• Suhu optimum
• Lama inkubasi optimum
• Kinetika reaksi (km dan vmaxs)
• Penentuan n terminal
• Penentuan c terminal
• Analisis urutan asam amino
• Modivikasi struktur (kimia / genetik)
Tidak ada komentar:
Posting Komentar