Google ads

Selasa, 14 Februari 2012

biomolekuler

     Penggunaan biokimia, mikrobiologi dan keteknikan kimia secara terpadu untuk menerapkan penanfaatan mikroba dan kultur jaringan.
         Spektrum bioteknologi sangat luas meliputi produksi pangan terfermentasi, antibiotika, enzim, alkohol, pelarut organik, vitamin, kultur sel, pengendalian limbah, pemurnian minyak, pengikatan nitrogen dll.
         Suatu ilmu terapan dengan biologi molekular sebagai ilmu dasarnya
         Suatu interaksi biologi dengan teknologi, melalui proses tranformasi biologis
Biologi molekuler
         Ilmu yang mempelajari seluk beluk struktur dan fungsi molekul kimia yg terdapat dalam sistem hidup (manusia, hewan, tubular dan mikroba)
         Bidang ini berkembang sangat pesat setelah tersingkapnya tabir rahasia struktur kimia dna, yaitu suatu senywa pembwa informasi sifat genetik. Mekanisme fungsi gen pada tingkat molekular merupakan pokok bahasan biologi molekuler.
         Sampai awal 1940-an, ilmu pengtahuan belum memiliki jawaban yg jelas tentang senyawa kimia apa yg berperan sebagai pembawa sifat genetika (hub sifat genotipe dan fenotipe><non fisik buas, pemarah, jinak, cerdas, periang, baik budi dll.
         Kita ketahui bahwa makhluk hidupdisusun oleh senyawa utama yaitu makromolekul (prot, lipid, karbohidrat dan as nukleat)
         Thn 1944, o.t. avery, c. Macleod dan m. Mccarty berhasil menjawab bahwa sifat genetik dibawa oleh dna bukan protein
         Kemudian diikuti oleh penemuan lainnya seperti struktur dna oleh watson dan crick (double helix, setiap putaran 10nucletida dng jarak 0,34nm)
         Sepotong untaian dna (‘gen’ ±1000pb) membewa pesan genetik membntuk polipeptida, selanjutnya bergabung menjadi protein (dogma sentral)
         Dogma sentral ada dua jalur yaitu sintesis protein dan replikasi gen (regenerasi)
         Protein merupkan komponen utama sel hidup, dan fungsi utamanya sebagai biokataisator dalam semua reaksi kimia di dalam sel hidup ‘enzim’, otot, struktur penunjang spt rambut, kulit dll.
         Sehingga informasi genetik suatu sel genotipe merupakan penentu sifat tampak luar ‘fenotipe’ (mutasi pada genetik akan menyebabkan perubahan fenotipe/fungsi)~penyakit genetik ‘anemia, talesimia i, 15122011
Sel
         Sel adalah unit terkecil dari kehidupan, oleh sebab itu memerlukan energi untuk melangsungkan berbagai proses metabolisme (pertumbuhan, perbaikan dan reproduksi)
         Semua reksi kimia yang terjadi di dalam sel dikatalisis oleh enzim
         Struktur setiap enzim (protein lainnya) dikodekan oleh satu segmen dna yang disebut gen
         Berdasarkan sumber karbon/ energinya, sel tebagi atas autotrof dan heterotrof, fototrof dan chemotrof
         Glikolisis: proses perubahan gula (glukosa) menjadi 2 molekul piruvat
         Setelah glikolisis: bisa terjadi fermentasi atau respirasi
         Fermentasi: proses tanpa o2, mengahsilkan asam atau alkohol
         Respirasi: penguraian secara sempurna untuk menghasilkan energi (atp)
Ruang lingkup & perkembangan
         Bioteknologi
         A. 1 mikrobiologi & biokimia
         􀂄 jumlah mikroba yang sudah dimanfaatkan untuk
         Bioteknologi masih sedikit →→ perlu upaya :
         􀂄 upaya tsb bertujuan untuk memperoleh mutan yg
         Memiliki sifat:
         􀂄 efisen dalam proses
         􀂄 dapat menggunakan bahan dasar yang lebih bervariasi
         􀂄 stabil selama proses dan dalam stock
         Isolasi seleksi
         Strain
         Improvement
         Screening

2. Fisiologi mikroba
􀂄 studi hubungan antara kemampuan
Metabolisme dengan lingkungan dimana
Mikroba berada baik dalam keadaan
Tumbuh/tidak tumbuh
􀂄 kemampuan memodifikasi sel:
􀀩 struktur sel
􀀩 kimia sel dan
􀀩 faal sel
􀂄 tujuan modifikasi :
Untuk menyebabkan
Metabolite over production
Agar dapat mengatasi feedback regulation
Dieksploitasi
(optimasi kondisi
Lingkungan)
Produk
/kemampuan yg
Diinginkan
3. Biokimia
􀂄 sintesis :
􀂄 metabolit primer
􀂄 metabolit sekunder
􀂄 enzim dan fungsi kimia sel yang lain
􀂄 katabolisme xenobiotic chemicals → waste
Treatment
􀂄 enzyme immobization
􀂄 isolasi, pemurnian molekul biologi &
Karakterisasi
B. Rekayasa genetik
berperan dalam strain improvement
Isolasi   wild  type      mutagenesis
seleksi mutan
Fermentasi metabolit primer
-ferm alkohol, asam cuka, asama sitrat, aasam amino, vitamin, enzim
Fermentasi metabolit sekunder
Mitotoksin,biopestisida,alakloid,pigmen, antibotik, enzim
Sampel mikroorganisme  (dari limbah dll)
         Isolasi (streak palte) dengan media yg sesuai
         Identifikasi (makroskopis &mikroskopis/ genetika) 5012012
Mikroba
Uji aktivitas secara kuali dan kuantitatif
Mikroba aktif
Produksi enzim
Isolasi, seleksi, pemuliaan dan preservasi mikroba
         Mo kecil hanya dapat dilihat dgn alat
         Oleh sebab itu keterangan sifat-sifat hidup  terbatas
         Pada umumnya yg dipelajari populasi mo yg terdiri atas jutaan bahkan milyaran sel
         Populasi yg ditumbuhkan dgn sengaja pada media dan kondisi tertentu disebut kultur
         Kultur ada yg murni (aksenik), kultur dua anggota atau kultur campuran.

Mikroba aktif
          induksi substrat
           pengaturan komposisi medium
         Pengaturan parameter fisika
         Crude enzymes ektracellular
(fraksi 0-20% ; fraksi 20-40% ; fraksi 40-60% ; fraksi 60-80% ; fraksi 80-100%) (nh4)2so4
Fraksi aktif
         Kromatografi kolom gel filtrasi sephadex g75
         Kromatografi kolom penukar ion deae cellulose

1. Karakterisasi enzim
2. Elektroforesis (sds page)

Isolasi dan pemurnian enzim
         Ekstrak enzim kasar (intra / ekstra sel)
         Fraksionasi dengan amonium sulfat
         Dialisis
         Pemekatan
         Chromatografi (filtrasi gel, penukar ion, afinitas, hplc dll)
         Uji kemurnian (elektroforesis)
         Penentuan parameter kinetika
Teknik isolasi dan pemurnian enzim
Pemisahan ekstrak enzim kasar (crude extrct)
  1. Pemecahan sel : (kimiawi/fisik)
            - alkali (naoh), lisozim dan edta, detergen
            -voter elvehjem (hand-operator or motordriven glass homogenizer (
            -blender (food processor)
            -ultrasonic probe
            -vibrating glass bead mill
            -dll (pendinginan mendadak/osmosis
2. Media ekstraksi: bufer yg mendekati pka
3. Ektraselular enzim diambil dari media
4. Fraksionasi dengan ammonium sulfat
-           solubilitas dlm air tinggi, tdk mengandung zat toksik terhadap enzim, murah, bisa sebagai stabilisator enzim
-           teknik awal dalam proses pemurnian enzim dan untuk pemekatan
-          Kelarutan molekul protein di dalam suatu pelarut ditentukan oleh distribusi muatan grup hidrofilik dan hidrofobik pada permukaan
-          ‘salting out’ effect  tergantung kepada sifat-sifat hidrofobik dari protein.
-          Penambahan garam akan mengikat molekul air yg ada pada protein dan akan membuka tapak hidrofobik
-          Tapak hidrofobik akan saling berinteraksi sehingga terjadi agregasi, namun untuk menghidari denaturasi termal, maka harus dilakukan pada suhu dingin 0-5oc
Kromatografi kolom filtrasi gel
         Memisahkan protein berdasarkan bobot molekul dan ukuran molekul
         Seperti sepahdex (gel dektran) dan diberi kode g dan angka dibelakannya menunjukan pengembangannya didalam air (g25 = pengembangan 25 kali)
         Bila larutan protein dari berbagai ukuran molekul dilewatkan ke dlam kolom filtrasi gel, maka molekul yg berukuran kecil akan masuk kedalam pori gel dan keluar lebih lambat.
         Molekul berukuran lebih besar akan keluar lebih cepat dan lewat diantara partikel gel.
         Memisahkan protein berdasarkan bobot molekul dan ukuran molekul
         Seperti sepahdex (gel dektran) dan diberi kode g dan angka dibelakannya menunjukan pengembangannya didalam air (g25 = pengembangan 25 kali)
         Bila larutan protein dari berbagai ukuran molekul dilewatkan ke dlam kolom filtrasi gel, maka molekul yg berukuran kecil akan masuk kedalam pori gel dan keluar lebih lambat.
         Molekul berukuran lebih besar akan keluar lebih cepat dan lewat diantara partikel gel.
Kromatografi kolom penukar ion
         Pemisahan terjadinya karena pertukaran ion sejenis antara zat yg berbeda dalam fasa mobil dengan zat yg terikat pada fasa stasioner.
         Dipengaruhi oleh kerapatan muatan, distribusi muatan, dan ukuran komponan yg dipisahkan
         Matrik berupa material inert seperti polistiren, divinil benzen atau polisakarida yang berikatan dngan molekul ion tertentu (deae, cm dan asam sulfonat)
         Deae selulosa memberikan amino nitroge
         N pada ph 9 berikatan dengan molekul bermuatan negatif (penukar anion) untuk protein yg stabil diatas pi
         Suatu protein bermuatan negatif dilewatkan ke matrik deae selulosa maka protein tersebut akan terikat, apabila kedalam kolom dialirkan garam, maka beberapa protein akan terlepas kembali sebanding dengan pengikatan muatan ionik dari garam tersebut
Sds-page
         Elektroforesis adalah teknik pemisahan protein berdasarkan bentuk, ukuran dan muatannya.
         Matrik yg sering digunakan adalah poli akrilamida atau agarosa
         Elektroforesis sds dapat menganalisis protein secara kualitatif dan kuantitatif
         Pada elektroforesis sds penambahan tiol akan memutus ikatan disulfida pada protein dan akan berikatan dengan sds membentuk muatan negatif
         Kecepatan migrasinya ditentukan oleh berat molekul polipeptida-sds
         Dengan menggunakan protein standar maka akan didapat berat molekulnya

Skema tahapan pemurnian enzim
Tahapan
Vol
(ml)
Akt
(u/ml)
Total
Akt
(u)
Kadar
Prot
(mg/ml)
Total
Prot
(mg)
Akt. Sp
(u/mg)
Perolehan kembali(%)
Faktor
Kemurnian (x)
Crude extract
725
1,10
890
0,56
406
1,99
‘100’
‘1,00’
F. Am. Sulfat
25
6,08
152
1,69
42,28
3,59
17,0
1,8
Krom. Filtrasi gel
30
8,83
134,7
1,35
17,6
20,66
15,1
10,38
Krom. Penukar ion
27
1,21
16,14
0,137
1,91
31,2
1,8
15,68
Karakterisasi enzim
         Ph optimu
         Suhu optimum
         Lama inkubasi optimum
         Kinetika reaksi  (km dan vmaxs)
         Penentuan n terminal
         Penentuan c terminal
         Analisis urutan asam amino
         Modivikasi struktur (kimia / genetik)


Tidak ada komentar:

Google Ads