biomolekuler

•     Penggunaan biokimia, mikrobiologi dan keteknikan kimia secara terpadu untuk menerapkan penanfaatan mikroba dan kultur jaringan.

•         Spektrum bioteknologi sangat luas meliputi produksi pangan terfermentasi, antibiotika, enzim, alkohol, pelarut organik, vitamin, kultur sel, pengendalian limbah, pemurnian minyak, pengikatan nitrogen dll.

•         Suatu ilmu terapan dengan biologi molekular sebagai ilmu dasarnya

•         Suatu interaksi biologi dengan teknologi, melalui proses tranformasi biologis

Biologi molekuler

•         Ilmu yang mempelajari seluk beluk struktur dan fungsi molekul kimia yg terdapat dalam sistem hidup (manusia, hewan, tubular dan mikroba)

•         Bidang ini berkembang sangat pesat setelah tersingkapnya tabir rahasia struktur kimia dna, yaitu suatu senywa pembwa informasi sifat genetik. Mekanisme fungsi gen pada tingkat molekular merupakan pokok bahasan biologi molekuler.

•         Sampai awal 1940-an, ilmu pengtahuan belum memiliki jawaban yg jelas tentang senyawa kimia apa yg berperan sebagai pembawa sifat genetika (hub sifat genotipe dan fenotipe><non fisik buas, pemarah, jinak, cerdas, periang, baik budi dll.

•         Kita ketahui bahwa makhluk hidupdisusun oleh senyawa utama yaitu makromolekul (prot, lipid, karbohidrat dan as nukleat)

•         Thn 1944, o.t. avery, c. Macleod dan m. Mccarty berhasil menjawab bahwa sifat genetik dibawa oleh dna bukan protein

•         Kemudian diikuti oleh penemuan lainnya seperti struktur dna oleh watson dan crick (double helix, setiap putaran 10nucletida dng jarak 0,34nm)

•         Sepotong untaian dna (‘gen’ ±1000pb) membewa pesan genetik membntuk polipeptida, selanjutnya bergabung menjadi protein (dogma sentral)

•         Dogma sentral ada dua jalur yaitu sintesis protein dan replikasi gen (regenerasi)

•         Protein merupkan komponen utama sel hidup, dan fungsi utamanya sebagai biokataisator dalam semua reaksi kimia di dalam sel hidup ‘enzim’, otot, struktur penunjang spt rambut, kulit dll.

•         Sehingga informasi genetik suatu sel genotipe merupakan penentu sifat tampak luar ‘fenotipe’ (mutasi pada genetik akan menyebabkan perubahan fenotipe/fungsi)~penyakit genetik ‘anemia, talesimia i, 15122011

Sel

•         Sel adalah unit terkecil dari kehidupan, oleh sebab itu memerlukan energi untuk melangsungkan berbagai proses metabolisme (pertumbuhan, perbaikan dan reproduksi)

•         Semua reksi kimia yang terjadi di dalam sel dikatalisis oleh enzim

•         Struktur setiap enzim (protein lainnya) dikodekan oleh satu segmen dna yang disebut gen

•         Berdasarkan sumber karbon/ energinya, sel tebagi atas autotrof dan heterotrof, fototrof dan chemotrof

•         Glikolisis: proses perubahan gula (glukosa) menjadi 2 molekul piruvat

•         Setelah glikolisis: bisa terjadi fermentasi atau respirasi

•         Fermentasi: proses tanpa o2, mengahsilkan asam atau alkohol

•         Respirasi: penguraian secara sempurna untuk menghasilkan energi (atp)

Ruang lingkup & perkembangan

•         Bioteknologi

•         A. 1 mikrobiologi & biokimia

•         􀂄 jumlah mikroba yang sudah dimanfaatkan untuk

•         Bioteknologi masih sedikit →→ perlu upaya :

•         􀂄 upaya tsb bertujuan untuk memperoleh mutan yg

•         Memiliki sifat:

•         􀂄 efisen dalam proses

•         􀂄 dapat menggunakan bahan dasar yang lebih bervariasi

•         􀂄 stabil selama proses dan dalam stock

•         Isolasi seleksi

•         Strain

•         Improvement

•         Screening

2. Fisiologi mikroba

􀂄 studi hubungan antara kemampuan

Metabolisme dengan lingkungan dimana

Mikroba berada baik dalam keadaan

Tumbuh/tidak tumbuh

􀂄 kemampuan memodifikasi sel:

􀀩 struktur sel

􀀩 kimia sel dan

􀀩 faal sel

􀂄 tujuan modifikasi :

Untuk menyebabkan

Metabolite over production

Agar dapat mengatasi feedback regulation

Dieksploitasi

(optimasi kondisi

Lingkungan)

Produk

/kemampuan yg

Diinginkan

3. Biokimia

􀂄 sintesis :

􀂄 metabolit primer

􀂄 metabolit sekunder

􀂄 enzim dan fungsi kimia sel yang lain

􀂄 katabolisme xenobiotic chemicals → waste

Treatment

􀂄 enzyme immobization

􀂄 isolasi, pemurnian molekul biologi &

Karakterisasi

B. Rekayasa genetik

berperan dalam strain improvement

Isolasi   wild  type      mutagenesis

seleksi mutan

Fermentasi metabolit primer

-ferm alkohol, asam cuka, asama sitrat, aasam amino, vitamin, enzim

Fermentasi metabolit sekunder

Mitotoksin,biopestisida,alakloid,pigmen, antibotik, enzim

Sampel mikroorganisme  (dari limbah dll)

•         Isolasi (streak palte) dengan media yg sesuai

•         Identifikasi (makroskopis &mikroskopis/ genetika) 5012012

Mikroba

Uji aktivitas secara kuali dan kuantitatif

Mikroba aktif

Produksi enzim

Isolasi, seleksi, pemuliaan dan preservasi mikroba

•         Mo kecil hanya dapat dilihat dgn alat

•         Oleh sebab itu keterangan sifat-sifat hidup  terbatas

•         Pada umumnya yg dipelajari populasi mo yg terdiri atas jutaan bahkan milyaran sel

•         Populasi yg ditumbuhkan dgn sengaja pada media dan kondisi tertentu disebut kultur

•         Kultur ada yg murni (aksenik), kultur dua anggota atau kultur campuran.

Mikroba aktif

•          induksi substrat

•           pengaturan komposisi medium

•         Pengaturan parameter fisika

•         Crude enzymes ektracellular

(fraksi 0-20% ; fraksi 20-40% ; fraksi 40-60% ; fraksi 60-80% ; fraksi 80-100%) (nh4)2so4

Fraksi aktif

•         Kromatografi kolom gel filtrasi sephadex g75

•         Kromatografi kolom penukar ion deae cellulose

1. Karakterisasi enzim

2. Elektroforesis (sds page)

Isolasi dan pemurnian enzim

•         Ekstrak enzim kasar (intra / ekstra sel)

•         Fraksionasi dengan amonium sulfat

•         Dialisis

•         Pemekatan

•         Chromatografi (filtrasi gel, penukar ion, afinitas, hplc dll)

•         Uji kemurnian (elektroforesis)

•         Penentuan parameter kinetika

Teknik isolasi dan pemurnian enzim

Pemisahan ekstrak enzim kasar (crude extrct)

1. Pemecahan sel : (kimiawi/fisik)

            - alkali (naoh), lisozim dan edta, detergen

            -voter elvehjem (hand-operator or motordriven glass homogenizer (

            -blender (food processor)

            -ultrasonic probe

            -vibrating glass bead mill

            -dll (pendinginan mendadak/osmosis

2. Media ekstraksi: bufer yg mendekati pka

3. Ektraselular enzim diambil dari media

4. Fraksionasi dengan ammonium sulfat

-           solubilitas dlm air tinggi, tdk mengandung zat toksik terhadap enzim, murah, bisa sebagai stabilisator enzim

-           teknik awal dalam proses pemurnian enzim dan untuk pemekatan

-          Kelarutan molekul protein di dalam suatu pelarut ditentukan oleh distribusi muatan grup hidrofilik dan hidrofobik pada permukaan

-          ‘salting out’ effect  tergantung kepada sifat-sifat hidrofobik dari protein.

-          Penambahan garam akan mengikat molekul air yg ada pada protein dan akan membuka tapak hidrofobik

-          Tapak hidrofobik akan saling berinteraksi sehingga terjadi agregasi, namun untuk menghidari denaturasi termal, maka harus dilakukan pada suhu dingin 0-5^oc

Kromatografi kolom filtrasi gel

•         Memisahkan protein berdasarkan bobot molekul dan ukuran molekul

•         Seperti sepahdex (gel dektran) dan diberi kode g dan angka dibelakannya menunjukan pengembangannya didalam air (g25 = pengembangan 25 kali)

•         Bila larutan protein dari berbagai ukuran molekul dilewatkan ke dlam kolom filtrasi gel, maka molekul yg berukuran kecil akan masuk kedalam pori gel dan keluar lebih lambat.

•         Molekul berukuran lebih besar akan keluar lebih cepat dan lewat diantara partikel gel.

•         Memisahkan protein berdasarkan bobot molekul dan ukuran molekul

•         Seperti sepahdex (gel dektran) dan diberi kode g dan angka dibelakannya menunjukan pengembangannya didalam air (g25 = pengembangan 25 kali)

•         Bila larutan protein dari berbagai ukuran molekul dilewatkan ke dlam kolom filtrasi gel, maka molekul yg berukuran kecil akan masuk kedalam pori gel dan keluar lebih lambat.

•         Molekul berukuran lebih besar akan keluar lebih cepat dan lewat diantara partikel gel.

Kromatografi kolom penukar ion

•         Pemisahan terjadinya karena pertukaran ion sejenis antara zat yg berbeda dalam fasa mobil dengan zat yg terikat pada fasa stasioner.

•         Dipengaruhi oleh kerapatan muatan, distribusi muatan, dan ukuran komponan yg dipisahkan

•         Matrik berupa material inert seperti polistiren, divinil benzen atau polisakarida yang berikatan dngan molekul ion tertentu (deae, cm dan asam sulfonat)

•         Deae selulosa memberikan amino nitroge

•         N pada ph 9 berikatan dengan molekul bermuatan negatif (penukar anion) untuk protein yg stabil diatas pi

•         Suatu protein bermuatan negatif dilewatkan ke matrik deae selulosa maka protein tersebut akan terikat, apabila kedalam kolom dialirkan garam, maka beberapa protein akan terlepas kembali sebanding dengan pengikatan muatan ionik dari garam tersebut

Sds-page

•         Elektroforesis adalah teknik pemisahan protein berdasarkan bentuk, ukuran dan muatannya.

•         Matrik yg sering digunakan adalah poli akrilamida atau agarosa

•         Elektroforesis sds dapat menganalisis protein secara kualitatif dan kuantitatif

•         Pada elektroforesis sds penambahan tiol akan memutus ikatan disulfida pada protein dan akan berikatan dengan sds membentuk muatan negatif

•         Kecepatan migrasinya ditentukan oleh berat molekul polipeptida-sds

•         Dengan menggunakan protein standar maka akan didapat berat molekulnya

Skema tahapan pemurnian enzim

Tahapan	Vol (ml)	Akt (u/ml)	Total Akt (u)	Kadar Prot (mg/ml)	Total Prot (mg)	Akt. Sp (u/mg)	Perolehan kembali(%)	Faktor Kemurnian (x)
Crude extract	725	1,10	890	0,56	406	1,99	‘100’	‘1,00’
F. Am. Sulfat	25	6,08	152	1,69	42,28	3,59	17,0	1,8
Krom. Filtrasi gel	30	8,83	134,7	1,35	17,6	20,66	15,1	10,38
Krom. Penukar ion	27	1,21	16,14	0,137	1,91	31,2	1,8	15,68

Karakterisasi enzim

•         Ph optimu

•         Suhu optimum

•         Lama inkubasi optimum

•         Kinetika reaksi  (km dan vmaxs)

•         Penentuan n terminal

•         Penentuan c terminal

•         Analisis urutan asam amino

•         Modivikasi struktur (kimia / genetik)