Kelarutan Protein

KELARUTAN PROTEIN
Oleh : Haiyul Fadhli

Didalam molekul protein terdapat asam amino hidrofilik dan asam amino hidrofobik. Setelah protein berikatan dalam larutan air, asam amino hidrofobik biasanya membentuk area perlindungan hidrofobik karena sifatnya tidak dapat berikatan dengan air sehingga air tidak dapat masuk kedalam area yang terdapat asam amino hidrofobik, sementara asam amino hidrofilik akan berikatan dengan molekul solven (air) dan memungkinkan protein untuk membentuk ikatan hidrogen dengan molekul air di sekitarnya. Jika pada permukaan protein terdapat asam amino hidrofilik yang cukup maka protein dapat larut dalam air.

1. Pengaruh pH
Seperti asam amino, protein yang larut dalam air akan membentuk ion yang mempunyai muatan positif dan negatif. Dalam suasana asam molekul protein akan membentuk ion positif, sedangkan dalam suasana basa akan membentuk ion negatif. Pada titik isolistrik protein mempunyai muatan positif dan negatif yang sama, sehingga tidak bergerak ke arah elektroda positif maupun negatif apabila ditempatkan di antara kedua elektroda tersebut. Protein mempunyai titik isolistrik yang berbeda-beda. Titik isolistrik protein mempunyai arti penting karena pada umumnya sifat fisika dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik ini. Pada pH di atas titik isolistrik protein bermuatan negatif, sedangkan di bawah titik isolistrik, protein bermuatan positif. Titik isolistrik pada albumin adalah pada pH 4,55-4,90
Adanya gugus amino dan karboksil bebas pada ujung-ujung rantai molekul protein, menyebabkan protein mempunyai banyak muatan (polielektrolit) dan bersifat amfoter (dapat bereaksi dengan asam maupun basa). Daya reaksi berbagai jenis protein terhadap asam dan basa tidak sama, tergantung dari jumlah dan letak gugus amino dan karboksil dalam molekul. Dalam larutan asam (pH rendah), gugus amino bereaksi dengan H+, sehingga protein bermuatan positif. Sebaliknya, dalam larutan basa (pH tinggi) molekul protein akan bereaksi sebagai asam atau bermuatan negatif. Pada pH isolistrik muatan gugus amino dan karboksil bebas akan saling menetralkan sehingga molekul bermuatan nol (Winarno, 2002).

2. Pengaruh Konsentrasi garam
Salting out
Ketika konsentrasi garam meningkat, sebagian dari molekul-molekul air akan tertarik oleh ion garam, yang kemudian akan mengurangi jumlah molekul air yang dapat berinteraksi dengan bagian hidrofobik protein. Sebagai akibat dari meningkatnya permintaan molekul solven , interaksi antar protein menjadi lebih kuat daripada interaksi antara pelarut dan zat terlarut, Hal ini akan menyebabkan molekul-molekul protein mengental dengan membentuk interaksi hidrofobik dengan satu sama lain. Proses ini dikenal sebagai salting-out.
Dalam pembahasan lain disebutkan bahwa salting out terjadi ketika pada konsentrasi garam yang tinggi, garam akan lebih cenderung mengikat air dan menyebabkan agregasi. Sehingga molekul protein mengalami presipitasi.

Salting in
Biasanya dalam air murni, protein sukar larut. Dengan adanya penambahan garam, kelarutan protein akan meningkat. Hal ini disebabkan oleh ion anorganik yang terhidrasi sempurna akan mengikat permukaan protein dan mencegah penggabungan (agregasi) molekul protein. Hal ini disebut salting in.

Hal ini seperti yang terjadi pada salting out, namun terjadi peningkatan kelarutan protein sehingga akan menyebabkan peningkatan ikatan hidrofillik dengan solven. Garam logam berat seperti Ag, Pb, dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat. Ikatan yang terbentuk amat kuat dan akan memutuskan jembatan garam, sehingga protein mengalami denaturasi. Secara bersama gugus –COOH dan gugus –NH2 yang terdapat dalam protein dapat bereaksi dengan ion logam berat dan membentuk senyawa kelat. Ion-ion tersebut adalah Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, Cu++, Co++, Mn++ dan Pb++. Selain gugus –COOH dan gugus –NH2, gugus –R pada molekul asam amino tertentu dapat pula mengadakan reaksi dengan ion atau senyawa lain. Gugus sulfihidril (-SH) pada molekul sistein akan bereaksi dengan ion Ag+ atau Hg++ (Poedjiadi, 1994). Dari hasil percobaan diketahiu bahwa reagsi antara logam berat dan albumin menghasilkan endapan, endapan yang paling banyak dihasilkan oleh AgNO3 diikuti HgCl2 dan Pb-asetat. Logam Ag dan Hg lebih reaktif daripada Pb kerena kedua logam tersebut merupakn logam transisi pada sistem periodik unsur. Garam logam berat sangat berbahaya bila sampai tertelan karena garam tersebut akan mendenaturasi sekaligus mengendapkan protein sel-sel tubuh. Hal ini seperti denaturasi oleh raksa (Hg) untuk pemurnian emas yang terjadi di Minamata, Jepang.
Kelarutan protein akan berkurang bila ke dalam larutan protein ditambahkan garam-garam anorganik, akibatnya protein akan terpisah sebagai endapan. Peristiwa pemisahan protein ini disebut salting out. Bila garam netral yang ditambahkan berkonsentrasi tinggi, maka protein akan mengendap. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang. Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan amoniumsulfat ((NH4)2SO4) hingga jenuh. Setelah larutan albumin dijenuhkan dengan (NH4)2SO4, uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air menunjukkan hasil positif (endapan larut membentuk butiran). Kemudian butiran direaksikan dengan pereaksi milon, dan bereaksi positif dengan ditandai endapan berwarna kemerahan. Uji filtrat dengan pereaksi biuret juga menunjukkan hasil poisitif yang ditandai larutan berwarna ungu violet. Pengujian endapan yang dihasilkan dengan pereaksi milon bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin, sedangkan pengujian filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan.

3. Denaturasi Protein
Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tertier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Karena itu, denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan molekul protein
Denaturasi protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Sejak diketahui reaksi denaturasi tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan peptida, dimana struktur primer protein tetap sama setelah proses denaturasi. Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur sekunder dan tersier protein. Pada struktur protein tersier terdapat empat jenis interaksi yang membentuk ikatan pada rantai samping seperti; ikatan hidrogen, jembatan garam, ikatan disulfida dan interaksi hidrofobik non polar, yang kemungkinan mengalami gangguan. Denaturasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi protein
Denaturasi, koagulasi dan redenaturasi dapat dibedakan sebagai berikut. Denaturasi protein adalah suatu keadaan telah terjadinya perubahan struktur protein yang mencakup perubahan bentuk dan lipatan molekul, tanpa menyebabkan pemutusan atau kerusakan lipatan antar asam amino dan struktur primer protein. Koagulasi adalah denaturasi protein akibat panas dan alkohol. Redenaturasi adalah denaturasi protein yang berlangsung secara reveresibel.
Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Protein telur mengalami denaturasi dan terkoagulasi selama pemasakan. Beberapa makanan dimasak untuk mendenaturasi protein yang dikandung supaya memudahkan enzim pencernaan dalam mencerna protein tersebut.
Pemanasan akan membuat protein bahan terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida. Proses ini biasanya berlangsung pada kisaran suhu yang sempit.

4. Pengukuran kelarutan protein
Percobaan kelarutan protein dilakukan dengan cara melarutkan protein ke dalam akuades pada pH yang berbeda. Setelah disentrifusi, akan terdapat dua fase, yaitu fase endapan dan fase supernatan. Kelarutan protein dapat diukur dari kadar protein terlarutnya. Semakin banyak protein yang larut di bagian supernatan, maka menunjukkan peningkatan kelarutan protein. Protein yang terlarut dapat diukur dengan metode penetapan protein, seperti metode Lowry. Metode Lowry adalah salah satu metode untuk mengukur kadar protein contoh berdasarkan pada prinsip-nya reaksi antara ion Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan (merupakan residu protein) yang akan menghasilkan warna biru.

Kurva Kelarutan Protein
Setiap protein mempunyai kelarutan tertentu yang ditentukan oleh komposisi larutannya. Kelarutan protein secara nyata dipengaruhi oleh pH dan umumnya mempunyai nilai yang minimum pada pH isoelektrik. Perubahan pH akan mempengaruhi ionisasi gugus fungsional protein sehingga muatan total protein berubah. Pada titik isoelektrik total muatan protein sama dengan nol, sehingga interaksi antar molekul protein menjadi maksimum.