Pengaturan Ekspresi Gen Eukariot

 Pendahuluan

Sel secara tepat mampu mengatur ekspresi gen. Sel prokariot dan eukariot mampu mengatur pola ekspresi gen dalam merespon perubahan kondisi lingkungan. Eukariot multiseluler mampu mengembangkan dan menjaga berbagai tipe sel dimana tiap-tiap sel memiliki genom yang sama namun mengekspresikan bagian gen yang berbeda.

Pengaturan atau kontrol ekspresi gen merupakan suatu pengaturan jumlah produk gen yang ada di dalam sel mahluk hidup. Gen-gen yang menyandi pembentukan produk semacam itu perlu diekspresikan terus-menerus sepanjang umur individu di hampir semua jenis sel tanpa bergantung kepada kondisi lingkungan di sekitarnya. Sementara itu, banyak pula gen lainnya yang ekspresinya sangat ditentukan oleh kondisi lingkungan sehingga mereka hanya akan diekspresikan pada waktu dan di dalam jenis sel tertentu yang harus ada mekanisme pengaturan ekspresinya.

Inisiasi transkripsi merupakan regulasi penting baik untuk ekspresi gen prokariot dan eukariot. Meskipun beberapa mekanisme pengaturan yang sama digunakan dalam kedua sistem, ada perbedaan mendasar dalam regulasi transkripsi pada eukariot dan bakteri.

Pada bakteri, RNA polimerase umumnya memiliki akses kesetiap promotor dan dapat mengikat dan memulai transkripsi di beberapa tingkat efisiensi dalam ketiadaan aktivator atau represor; keadaan dasar transkripsi adalah nonrestriktif. Pada eukariot bagaimanapun promotor umumnya tidak aktif secara in vivo dengan tidak adanya protein regulator, yaitu keadaan dasar transkripsi adalah restriktif. Setidaknya ada empat perbedaan penting yang membedakan regulasi ekspresi gen eukariot dengan bakteri.

Pertama, akses ke promotor eukariot dibatasi oleh struktur kromatin, dan aktivasi transkripsi dikaitkan dengan banyak perubahan dalam struktur kromatin di wilayah transkripsi. Kedua, meskipun sel eukariot memiliki baik mekanisme regulasi positif dan negatif, mekanisme positif mendominasi disemua sistem sejauh ini. Jadi, mengingat bahwa keadaan dasar transkripsi adalah restriktif, dan hampir setiap gen eukariot membutuhkan aktivasi yang akan ditranskripsi. Ketiga, sel eukariot lebih besar, multi regulasi protein kompleks dibanding bakteri. Keempat, transkripsi pada eukariot terdapat di inti sel dan pada prokariot di sitoplasma.

Transkripsi Kromatin Aktif Secara Struktural Berbeda dari Kromatin yang Tidak Aktif

Efek dari struktur kromosom pada regulasi gen pada eukariot tidak memiliki persaman yang jelas dalam prokariot. Pada siklus sel eukariot, interphase kromosom muncul, pada tampilan pertama, yang akan tersebar dan amorf. Namun demikian, beberapa bentuk kromatin dapat ditemukan di sepanjang kromosom. Sekitar 10% dari kromatin dalam sel eukariot adalah dalam bentuk yang lebih padat daripada bagian kromatin. Bentuk heterokromatin merupakan bentuk transkripsi tidak aktif. Misalnya, heterokromatin umumnya dikaitkan dengan struktur kromosom-sentromer tertentu. Eukromatin merupakan bentuk kromatin yang kaya akan gen dan memiliki warna yang lebih terang dibanding heterokromatin.

Transkripsi dari gen eukariot sangat ditekankan ketika DNA-nya dikondensasikan dalam heterokromatin. Beberapa dari eukromatin adalah transkripsi aktif. Nuklease seperti DNase I cenderung memotong isolasi DNA kromatin menjadi fragmen-fragmen dari kelipatan sekitar 200 bp, yang mencerminkan pengulangan struktur dari nukleosom. Pada daerah transkripsi aktif, fragmen yang dihasilkan oleh aktivitas nuklease lebih kecil dan ukurannya lebih heterogen.  Daerah ini berisi situs hipersensitif,  terutama sekuens yang sensitif terhadap DNase I, yang terdiri dari sekitar 100 sampai 200 bp. Dalam beberapa gen, situs hipersensitif ditemukan jauh dari ujung 5’, dekat ujung 3’, atau bahkan di dalam gen itu sendiri.

Banyak situs hipersensitif sesuai dengan mengikat situs yang dikenal untuk pengaturan protein, dan tidak adanya relatif nukleosom di wilayah ini dapat memungkinkan pengikatan protein tersebut. Nukleosom sepenuhnya absen di beberapa daerah yang sangat aktif dalam transkripsi, seperti gen rRNA. Transkripsi aktif kromatin cenderung kekurangan histon H1, yang mengikat DNA linker antara partikel nukleosom.

Remodeling Kromatin oleh Asetilasi dan Perpindahan Nucleosomal

Kromatin adalah suatu kompleks genom DNA dan protein kromosomal yang terdapat dalam nukleus eukariot. Kromatin tersusun atas serabut-serabut kromatin (nukleosom), dimana keadaan dan  posisi   kromatin  pada   saat   transkripsi   akan  sangat  mempengaruhi   ekspresi   sebuah   genom.

Tingkat pengepakan protein yang dipengaruhi oleh ketepatan struktur kimia protein histon di dalam nukleosom, akan sangat berpengaruh pada ekspresi suatu genom. Mekanisme rinci transkripsi terkait perubahan struktural dalam kromatin, yang disebut remodeling kromatin, termasuk identifikasi dari berbagai enzim yang terlibat langsung dalam proses. Termasuk juga enzim yang kovalen memodifikasi inti histon nukleosom dan lain-lain yang menggunakan energi kimia ATP untuk merombak nukleosom pada DNA.

Proses   remodeling   kromatin   terdiri   dari   remodeling   protein   histon   dan   remodeling nukleosom. Remodeling protein dapat terjadi melalui:

1). Asetilasi,

2). Metilasi,

3). Fosforilasi, dan

4). Ubiquitinasi.

Modifikasi ini mempengaruhi struktur kromatin dan berdampak terhadap aktivitas seluler. Asetilasi protein terjadi melalui pengikatan grup asetil pada asam amino lisin di daerah ujung N dari sumbu histon, yang dapat mengurangi afinitas histon terhadap DNA dan dapat mengurangi interaksi antar nukleosom yang akan membentuk serabut 30 nm dari kromatin. Apabila ujung N dapat terikat dengan salah satu proses remodeling protein, maka akan membentuk ikatan yang kurang kompak (longgar) sehingga dapat mempengaruhi ekspresi gen. Enzim yang berperan adalah Histon Acetyl Transferase (HAT). Di dalam nukleus, HAT membentuk kompleks multiprotein seperti kompleks ADA dan SAGA pada ragi. Kompleks yang berbeda mengasetilasi histon yang berbeda, sebagian lagi mengasetilasi protein lain yang berperan dalam ekspresi genom seperti faktor transkripsi basal TFIIE dan TFIIF.

Modifikasi histon dengan  pengikatan gugus metil pada lisin ke-9 membentuk situs pengikatan bagi protein HP1 yang menginduksi pengepakan kromatin dan membungkam ekspresi gen. Tetapi metilasi pada lisin ke-4 mendorong pembentukan struktur kromatin yang lebih longgar. Dalam domain fungsional β-globin, metilasi lisin ke-4 diduga berhubungan dengan asetilasi histon H3. Jadi, posisi metilasi akan menentukan struktur kromatin yang terbentuk.

Fosforilasi histon H3 dan histon linker, berhubungan dengan pembentukan   kromosom metafase yang terjadi selama siklus pembelahan sel. Fosforilasi mengakibatkan terbentuknya kromatin yang lebih longgar, sehingga Deoksiribonuklease I (DNAse I) dapat  mengaksesnya. Ubiquitinasi histon H2B berhubungan dengan pengaturan siklus sel.  Keempat  remodeling histon tersebut   akan menghasilkan struktur kromatin yang kurang kompak (eurokromatin) sehingga gen-gen yang terkandung di dalamnya dapat diekspresikan.

Remodeling nukleosom  juga dapat  mempengaruhi  ekspresi  gen.  Remodeling nukleosom merupakan modifikasi/reposisoning nukleosom dalam suatu daerah pendek dalam genom, sehingga DNAse I dapat mengakses situsnya. Proses ini berlangsung dengan menggunakan energi yang melemahkan kontak antar nukleosom dan DNA. Macamnya adalah:

1).  Remodeling: perubahan struktur nukleosom tetapi tidak melibatkan perubahan posisi.

2). Sliding (cis-displacement): pemindahan nukleosom secara fisik disepanjang molekul DNA.

3). Transfer (trans-displacement):  pemindahan nukleosom ke  molekul  DNA yang  lain  atau kebagian yang tidak berurutan pada molekul yang sama.

Protein-protein yang berperan dalam remodeling kromatin saling bekerjasama dalam suatu kompleks  besar. Salah satunya adalah SWI/SNF pada eukariot, yang sedikitnya tersusun dari 11 protein. Adanya interaksi antara SWI/SNF dan HATs menunjukkan bahwa remodeling nukleosom dapat berhubungan dengan asetilasi histon, yang berarti bahwa remodeling   nukleosom juga memungkinkan untuk terekspresinya suatu genom.

Promotor Eukariot Banyak yang bersifat sebagai Pengaturan Positif

RNA polimerase eukariot memiliki sedikit atau tidak ada afinitas intrinsik untuk promotor mereka; inisiasi transkripsi hampir selalu tergantung pada tindakan aktivator protein ganda. Salah satu alasan penting regulasi positif sangat berperan yaitu penyimpanan DNA dalam kromatin efektif membuat promotor tidak dapat diakses, sehingga gen biasanya diam dengan tidak adanya pengaturan lain. Struktur kromatin mempengaruhi akses ke beberapa promotor yang lainnya, tetapi sering terjadi represor yang berikatan dengan DNA sehingga dapat menghalangi akses RNA polimerase (pengaturan negatif). Faktor lain yang berperan dalam penggunaan pengaturan positif, yaitu besarnya ukuran genom eukariot dan efisiensi pengaturan positif yang lebih besar. Spesifisitas untuk aktivasi transkripsi dapat ditingkatkan jika setiap beberapa pengaturan positif protein harus mengikat urutan DNA tertentu dan kemudian membentuk kompleks dalam rangka untuk menjadi aktif. 

Tabel 1. Beberapa Kompleks Enzim yang Mengkatalisis Perubahan Struktural Kromatin Terkait dengan Transkripsi

DNA Binding Transactivators dan Coactivators Memfasilitasi Faktor transkripsi Umum

Meskipun sebagian besar (tetapi tidak semua) Pol II promotor termasuk TATA box dan sekuens Inr (inisiator), dengan jarak standar mereka (lihat Gbr. 26-8), mereka sangat bervariasi baik dalam jumlah dan lokasi urutan tambahan diperlukan untuk pengaturan transkripsi. urutan pengaturan tambahan Ini biasanya disebut enhancer pada eukariota dan upstream activator sequences (UASs) dalam ragi. Sebuah khas penambah dapat ditemukan ratusan atau bahkan ribuan pasangan basa hulu dari situs awal transkripsi, atau bahkan mungkin menjadi hilir, dalam gen itu sendiri. Ketika terikat oleh regulasi protein yang tepat, sebuah peningkatan penambah transkripsi pada promotor terdekat terlepas dari yang orientasi dalam DNA. Fungsi UASs ragi dengan cara yang sama, meskipun umumnya mereka harus diposisikan hulu dan dalam beberapa ratus beberapa pasang dasar situs transkripsi start. Pol II promotor dapat dipengaruhi oleh setengah lusin urutan pengaturan jenis ini, dan bahkan promotor lebih kompleks cukup umum.

Sukses pengikatan RNA polimerase II aktif holoenzyme di salah satu promotor yang biasanya membutuhkan aksi protein lain (Gambar 28-27), dari tiga jenis: (1) faktor transkripsi basal (lihat Gbr. 26-9, Tabel 26-1), diperlukan pada setiap promotor Pol II, (2) DNAbinding transactivators, yang mengikat enhancer atau UASs dan memfasilitasi transkripsi, dan (3) coactivators. Tindakan kedua kelompok secara tidak langsung bukan dengan mengikat DNA dan diperlukan untuk komunikasi penting antara DNA-binding transactivators dan kompleks terdiri dari Pol II dan faktor transkripsi umum. Selanjutnya, berbagai protein represor dapat mengganggu dengan komunikasi antara RNA polimerase dan DNA-binding transactivators, hingga represi transkripsi. 

Peran enhancer dalam pengaturan ekspresi gen pada eukariot

Pengaturan ekspresi gen pada eukariot melibatkan enhancer, protein aktivator, dan faktor transkripsi. Peran enhancer dalam ekspresi gen yaitu untuk mengenali situs protein aktivator. Protein inilah yang akan merangsang terjadinya transkripsi dengan cara berinteraksi dengan RNA polimerase, faktor transkripsi dan promotor. Letak atau posisi enhancer yang jauh dari promotor yang menyebabkan pembentukan loop agar DNA dapat berinteraksi. Pengontrolan ekspresi gen pada eukariot sangat dipengaruhi oleh kerjasama antara faktor transkripsi dan enhancer.

                         

TATA-Binding Protein 

Komponen pertama untuk mengikat dalam pemasangan kompleks pra-inisiasi di TATA box dari tipe promotor Pol II adalah protein TATA-binding (TBP). Kompleks lengkap meliputi faktor transkripsi basal (umum) TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH; Pol II; dan mungkin TFIIA. TFIID adalah protein pertama yang mengikat DNA selama pembentukan pra-inisiasi transkripsi kompleks RNA polimerase II (RNA Pol II). Pengikatan dari TFIID ke TATA box dalam daerah promotor gen memulai merangsang faktor lain yang diperlukan oleh RNA Pol II untuk memulai proses transkripsi. Masing-masing faktor transkripsi terbentuk dari interaksi antara banyak subunit protein.

DNA Binding Transactivators

Persyaratan untuk transaktivator sangat bervariasi dari satu promotor dengan yang lainnya. Sedikit transaktivator yang dikenal untuk memfasilitasi transkripsi di ratusan promotor, sedangkan yang lainnya khusus untuk beberapa promotor. Banyak transaktivator yang sensitif untuk pengikatan sinyal molekul, menyediakan kapasitas untuk mengaktifkan atau menonaktifkan transkripsi dalam menanggapi perubahan lingkungan selular. Beberapa enhancer terikat oleh DNA-binding transactivators cukup jauh dari promotor TATA box.  Protein  High Mobility Group (HMG) memainkan peran struktural penting dalam remodeling transkripsi dan aktivasi kromatin.

Coaktivator Protein Kompleks

Transkripsi sangat membutuhkan kehadiran kompleks protein tambahan. Beberapa pengaturan protein kompleks yang berinteraksi dengan Pol II telah didefinisikan baik secara genetik dan biokimia. Kompleks coaktivator bertindak sebagai perantara antara DNA-binding transactivators dengan Pol II kompleks.

Pada eukariot, TFIID adalah sebuah kompleks besar yang mencakup TBP dan sepuluh atau lebih TBP-associated factor (TAFs). Beberapa TAFs mirip histon dan mungkin memainkan peran dalam menggusur nukleosom selama proses aktivasi transkripsi. Banyak DNA-binding transactivators membantu dalam proses inisiasi transkripsi dengan berinteraksi dengan satu atau lebih TAFs. Persyaratan untuk TAFs untuk memulai transkripsi sangat bervariasi antara satu gen dengan gen yang lainnya. Beberapa promotor memerlukan TFIID, beberapa tidak, dan beberapa memerlukan subset hanya dari subunit TAF TFIID.

Coactivator penting yang lain terdiri dari 20 atau lebih polipeptida di sebuah kompleks protein yang disebut mediator. Mediator mengikat erat ke karboksil-terminal domain (CTD) pada subunit Pol II yang terbesar. Kompleks mediator diperlukan untuk kedua basal dan pengaturan transkripsi pada promotor digunakan oleh Pol II, dan juga merangsang fosforilasi dari CTD oleh TFIIH. Kedua mediator dan TFIID diperlukan oleh beberapa promotor. Seperti TFIID, beberapa DNAbinding transactivators berinteraksi dengan satu atau lebih komponen dari kompleks mediator. Coactivator kompleks berfungsi pada atau dekat TATA box promotor.

Koreografi Aktivasi transkripsi 

Kita sekarang dapat mulai untuk menyusun urutan aktivasi transkripsi pada promotor Pol II. Pertama, remodeling kromatin berlangsung secara bertahap. Beberapa DNA-binding transaktivator memiliki afinitas signifikan untuk mengikat situs mereka, bahkan ketika situs yang terdapat dalam kromatin padat. Pengikatan satu transaktivator dapat memfasilitasi pengikatan yang lainnya yang secara bertahap menggantikan beberapa nukleosom.

Transaktivator yang terikat kemudian dapat berinteraksi langsung dengan HAT atau kompleks enzim seperti SWI/SNF (atau keduanya), mempercepat remodeling disekitar kromatin. Dengan cara ini, sebuah transaktivator yang terikat dapat menarik kedalam komponen lainnya yang diperlukan untuk remodeling kromatin untuk dapat melakukan transkripsi gen tertentu. Transaktivator yang terikat umumnya bertindak melalui komplek seperti TFIID atau mediator (atau keduanya), menstabilkan pengikatan Pol II dan terkait faktor transkripsi dan sangat memudahkan pembentukan kompleks pra-inisiasi transkripsi.

Aktivasi  Transkripsi Reversible

Meskipun jarang, beberapa pengaturan protein eukariot yang mengikat promotor Pol II dapat bertindak sebagai represor, pembentukan menghambat kompleks pra-inisiasi aktif. Beberapa transaktivator dapat mengadopsi konformasi yang berbeda, memungkinkan mereka dapat bertindak sebagai aktivator transkripsi atau represor. Sebagai contoh, beberapa reseptor hormon steroid berfungsi didalam inti sebagai DNAbinding transaktivator, merangsang transkripsi gen tertentu ketika hadirnyasinyal hormon steroid tertentu. Ketika hormon tidak ada, reseptor protein kembali ke konformasi represor, mencegah pembentukan kompleks pra-inisiasi. 

GAMBAR 2 Promotor eukariot dan regulasi protein.

Keterangan gambar 1. RNA polimerase II dan faktor transkripsi umum membentuk pra-inisiasi kompleks pada TATA box dan situs Inr dari promoto, suatu proses yang difasilitasi oleh DNA-binding transactivators, bertindak melalui TFIID dan/atau mediator. (a) gabungan promotor dengan sekuens unsur dan kompleks protein yang ditemukan di kedua ragi dan eukariot tingkat tinggi. Karboksil-terminal domain (CTD) dari Pol II merupakan titik penting dari interaksi dengan mediator dan protein kompleks lainnya. Kompleks protein yang diperlukan untuk asetilasi histon dan remodeling kromatin tidak ditampilkan. Untuk DNA-binding transactivators, DNA-binding domain lainnya berwarna hijau, aktivasi domain dalam merah muda. Interaksi disimbolkan dengan panah biru. (b) Berbagai macam fungsi represor transkripsi eukariot dengan berbagai mekanisme. Beberapa mengikat langsung ke DNA, menggusur kompleks protein yang diperlukan untuk aktivasi, yang lain berinteraksi dengan berbagai bagian dari transkripsi atau kompleks aktivasi untuk mencegah aktivasi. Interaksi ditandai dengan panah merah.