Uji Mikroba Secara Kolorimetrik (XTT)

    

XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide) akan direduksi menjadi suatu derivat formazan yang larut, warnanya oren terang. Keunggulan dg XTT tidak perlu menambahkan zat utk melarutkan formazan.

1.      Cara kerja uji XTT

XTT digunakan untuk mengamati kelangsungan hidup dari suatu sel menggunakan potesial redoks. Sel aktif respiring mengkonversi XTT (yang mudah larut dalam air) produk formazan berwarna oranye. Tidak seperti MTT, XTT tidak memerlukan solubilisasi sebelum dilakukan pengujian, sehingga mengurangi waktu uji. Selain itu, sensitivitas reduksi XTT dilaporkan sama dengan atau lebih baik daripada uji reduksi MTT.

1. Sel diletakkan didalam plat 96-well plate. Tambahkan 100 uL media pertumbuhan disetiap well. Sl diinkubasi dalam inkubator CO2 pada suhu 37oC. Pada beberapa test menggunakan uji poliferasi setelah 24-96 jam. Setiap test harus termasuk blank yang berisi media.

2. Defrost reagent XTT dan larutan harus di aktivasi segera dengan menggunakan water bath pada suhu 37oC dan diaduk

3. Untuk membuat larutan pereaksi, untuk setiap 1 well plate (96 well) tambahkan 0,1 mL larutan aktivasi pada setiap 5 mL reagen XTT

4. Tambahkan 50 uL larutan pereaksi pada setiap well dan diinkubasi selama 2-24 jam (biasanya 2-5 jam)

5. Kocok plate untuk mencampurkan reagen pada plate

6. Ukur absorbansi sample dan blank sebagai kontrol background dengan spektrofotometer (ELISA reader) pada panjang gelombang 450-500 nm.

7. Absorbansi background tergantung kepada kultur media, pH, waktu inkubasi dan lama terpapar oleh sinar. Persiapkan lebih dari 1 blank kontrol.

Cara kerja uji MTT

a. Peletakan Larutan Uji

Plat uji yang berisi sel dan telah diinkubasi selama 24 jam. Setiap bagian dirancang untuk empat kali replikasi.  Peletakan larutan uji dimulai dari konsentrasi paling rendah. Pindahkan 20 μl larutan uji ke dalam masing-masing sumur uji. Ke dalam sumur kontrol masukkan 20 μl media, dan blanko hanya diisi dengan 200 μl media. Plat kembali diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator 370C/ 5% CO2. Amati perubahan yang terjadi pada sel selama masa inkubasi

b. Peletakan Larutan MTT

Larutan MTT 5 mg/ml dipipet 50 μl ke dalam masing-masing sumur. Kemudian inkubasi selama 3-4 jam pada 370C, 5% CO2. Setelah 3-4 jam, akan terlihat adanya endapan ungu kristal formazan. Medium yang mengandung reagen MTT dibuang dengan cara dihisap dari setiap sumur, sehingga yang tertinggal hanya endapan ungu kristal formazan. Larutkan endapan pada setiap sumur dengan 100 μl DMSO. Ukur serapannya dengan spektrofotometer micrroplate pada λ 550 nm.

Cara Kerja Uji Resazurin

Tes resazurin adalah tes yang paling banyak digunakan untuk kebersihan dan potensi menjaga kualitas susu. Resazurin adalah indikator pewarna. Dalam kondisi tertentu resazurin dilarutkan dalam air suling. Larutan resazurin nantinya dapat digunakan untuk menguji aktivitas mikroba dalam sampel susu yang diberikan.

Resazurin dapat dilakukan dalam beberapa test:

Test 10 menit, 1 jam, dan 3 jam.

Test 10 menit mempunyai kelebihan lebih cepat, tes skrining yang digunakan di platform susu. Tes 1 jam dan 3 jam memberikan informasi yang lebih akurat tentang kualitas susu, tapi membutuhkan waktu lebih lama. Biasanya dilakukan di laboratorium.

Alat dan Bahan :

•           Resazurin tablets

•           Test tubes with 10 mls mark

•           1 ml pipette or dispenser for Resazurin solution.

•           Water bath thermostatically controlled

•           Lovibond comparator with Resazurin disc 4/9

Prosedur:

Larutan resazurin yang telah dipersiapkan dengan menambahkan satu tablet ke dalam 50 mL air suling steril. Solusi Rasazurin tidak boleh terkena sinar matahari, dan tidak boleh digunakan selama lebih dari delapan jam karena akan kehilangan efektifitasnya.

Campur susu dan pipet menggunakan pipet steril sebanyak10 ml susu ke dalam tabung reaksi steril.

Tambahkan 1 mL larutan resazurin, stopper dengan stopper steril, aduk pewarna ke dalam susu dan menandai tabung sebelum inkubasi dalam waterbath, tempatkan tabung reaksi dalam komparator Lovibond dengan resazurin disk dan membandingkannya secara colourimetrically dengan tabung reaksi berisi 10 ml susu dari sampel yang sama sebagai blank.

Berikut tabel untuk komparasi secara colourimetri

Resazurin disc No.	Colour	Grade of milk	Action
6	Blue	Excellent	Accept
5	Light blue	v. good	Accept
4	Purple	Good	Accept
3	Purple pink	Fair	Separate
2	Light pink	Poor	Separate
1	Pink	Bad	Reject
0	white	Very bad	Reject