“ISOLASI DNA PLASMID”

Plasmid merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kurang lebih 2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang penting untuk pertumbuhan bakteri. Di alam, gen informasi ini sering mengkode protein yang akan membuat bakteri resisten terhadap antibiotik. Plasmid mungkin merupakan hasil dari perkembangan heterotrop yang tertutup. Bakteri sering tumbuh pada lingkungan yang sama dengan mold dan fungi dan berkompetisi dengan mereka untuk mendapatkan makanan (bahan organik kompleks). Sebagai hasilnya,m old dan fungi menghasilkan toksin untuk membunuh bakteri (dalam dunia kedokteran sering deisebut dengan antibiotik) agar supaya menang dalam memperebutkan makanannya. Untuk menanggapi ini bakteri menghasilkan plasmid untuk mempertahankan hidupnya . Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang terjadi secara alamiah pada bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara simbiotik maupun parasitik pada sel inang.

Berdasarkan fungsinya plasmid dapat dikelompokkan menjadi:

1. Fertility- F plasmids. Merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel bakteri lain untuk proses konjugasi. Plasmid ini juaga mempunyai kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen baik yang terdapat dalam plasmid ataupun dalam kromosom. Plasmid ditemukan antara lain pada Eschericia coli, Pseudomonas, dan Streptomyces. 
2. Resistance- R plasmids. Mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau racun dan inhibitor pertumbuhan lainnya. Plasmid R dapat ditemukan pada Staphylococcus
3. Plasmid penyandi bacteriocins adalah senyawa yang diproduksi oleh bakteri untuk menghambat pertumbuhan .Resistance- R plasmids. Mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau buhan atau bakteri lain yang spesises atau galurnya berbeda. Plasmid ini mengandung gen struktural bacteriocins ataupun gen yang mengkode protein yang berperan dalam pemrosesan dan transport bacteriocins. Penamaan plasmid ini tergantung pada organisme yang memproduksinya. Misalnya plasmidCol pada bakteri Escherichia coli yang mengkode colicins.
4. .Degradative plasmids. Merupakan plasmid yang mampu mencerna subsansi yang tidak biasa, contoh toluen dan asam salisilat.
5. Virulence plasmids. Merupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut patogen

Berbagai macam bentuk plasmid itu akan mempengaruhi kecepatan migrasi plasmid dalam elektroforesis. Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid tersebut dari yang paling cepat adalah supercoiled, supercoiled denaturated, relaxed circular, dan nicked open circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil atau ramping akan lebih mudah bergerak melalui pori gel agarose sehingga akan mencapai bagian bawah terlebih dahulu. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu. Karena plasmid memiliki fungsi yang bisa dimanfaatkan keuntungannya, maka ada banyak cara yang digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µg) digunakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µg.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yang dapat digunakan untuk isolasi plasmid antara lain yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion.

Tujuan “Isolasi DNA Plasmid” ini untuk mengisolasi DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli. Bakteri yang digunakan untuk diambil plasmidnya adalah bakteri Escherchia coli dikarenakan:

1. Mudah didapatkan.

2. Menghasilkan keturunan yang banyak dalam waktu yang singkat.

Beberapa teknik dapat digunakan untuk merusak sel Escherchia coli, untuk melepaskan molekul DNA plasmid. Metode yang digunakan pada isolasi DNA plasmid ini adalah metode alkali lisis atau lisis basa. Lisis basa adalah perusakan sel pada pH tinggi dengan NaOH dan SDS (sodium Duodenyl Sulfat), diikuti dengan pelepasan dan denaturasi DNA genomik (gDNA), material dinding sel, dan kebanyakan protein seluler. Meskipun DNA plasmid super coil juga terpengaruh karena rusaknya ikatan hidrogen akibat promosi basa, jika pH dijaga di bawah 12,5 pasangan basa terjaga dari pemisahan sempurna untai komplementer. Basa-basa berperan sebagainuclei untuk renaturasi sempurna molekul DNA plasmid selama tahap netralisasi.

Jika lisis sel dilakukan pada pH di atas 12,5, atau jika pH ekstrim dalam

larutan, pasangan basa plasmid dapat lepas dan terjadi denaturasi, membentuk pDNA

single stranded. Setelah tahap lisis, larutan dinetralisasi dengan kalium asetat, yang mengendapkan SDS bersama-sama dengan gDNA terdenaturasi dan debris seluler. Pengerjaan berbeda dapat menghilangkan material tidak larut ini, sedangkan mayoritas pDNA tinggal dalam supernatan. Selama manipulasi, harus dijaga supaya tidak terjadi pemutusan gDNA membentuk fragmen-fragmen kecil yang tidak akan membentuk agregat.

Langkah pertama yang dilakukan adalah mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair yang telah dipersiapkan dengan menggunakan mikropipet dan memasukkannya ke dalam tabung eppendorf 15 ml. Kemudian mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal menyebabkan komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang biasa disebut dengan pellet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih kecil akan berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan. Dalam hal ini, sel bakteri Escherchia coli akan berada pada pellet sehingga kita mengambil pelletnya dan membuang bagian supernatan. Setelah itu menambahkan larutan A yang berisi Tris-HCl dan EDTA untuk mensuspensi pelet sampai larut dengan cara divortex. Di sini penmabahan larutan A akan membuat berat molekul sel menjadi lebih besar sehingga nantinya akan terendap sebagai pellet setelah disentrifuge. EDTA dapat berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Selain itu Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada pH nya.

Langkah selanjutnya adalah menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan larutan A lalu dibolak-balik 4-6 kali. Penambahan larutan B ini bertujuan untuk melisiskan dinding sel bakteri di mana SDS berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan mendenaturasi protein serta NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan mulai menghidrolisis RNA. Sehingga DNA kromosomal akan kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi dan yang dapat diperoleh setelah proses ini kemungkinan besar adalah DNA plasmid.

Berikutnya kami menambahkan larutan C yang berisi kalium asetat sebanyak 2 ml. Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid mengendapnya  single stranded DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi serta pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Penambahan juga berfungsi untuk menetralkan pH sehingga DNA plasmid tidak rusak. Setelah itu disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm. Setelah penambahan larutan netralisasi ini dihindari penggunaaan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA kromosomal yang mungkin masih ada akan menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatan yang berisi DNA plasmid. Jadi, pada akhir tahap isolasi ini bagian yang diambil adalah supernatan yang mengandung DNA plasmid dan membuang pellet yang mengandung debris molekuler. Supernatan diambil sebanyak 4 ml kemudian didiamkan selam 1 malam.

Dari hasil percobaan, setelah ditambahkan larutan A, larutan B, dan larutan c ternyata hanya diperoleh sedikit pellet dan supernatant tampak keruh. Hal ini mungkin terjadi karena debris molekul tidak semuanya mengendap sebagai pellet namun masih tercampur dalam supernatan bersama plasmid sehingga supernatan tampak keruh. Tidak mengendapnya semua debris molekul mungkin disebabkan pada saat penambahan larutan A sebagai larutan suspensi, EDTA yang berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil belum bereaksi secara optimal. Selain itu Tris- HCl yang berfungsi menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada pH nya

juga belum bereaksi optimal. Akibatnya, Tidak semua debris molekul dapat terendapkan sesuai ukuran dan berat molekulnya dan mencemari supernatan sehingga tampak keruh. Hal ini dapat juga disebabkan oleh kurang berfungsinya larutan B dalam melisiskan dinding sel bakteri sehingga tidak semua dinding dan sitoplasma dapat dirusak. Atau mungkin pula ketika mengambil kultur bakteri atau ketika menambahkan larutan, baik larutan A maupun larutan B, tip menyentuh dinding tabung sehingga plasmid terkontaminasi zat-zat pengotor. Dapat pula saat pengambilan kutur bakteri, ketika pengambilan pellet ternyata supernatan juga ikut terambil sehingga menyebabkan setelah penambahan larutan A, larutan B, dan larutan C, pellet sedikit dan supernatant menjadi keruh.

Pada tahap presipitasi kami menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan ethanol 0,4 ml SodAc (Sodium Asetat) dan 10 ml larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam. Penambahan ethanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas. Ethanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Prinsip pengendapan dengan menggunakan ethanol absolut dingin yaitu : Saat penambahan garam yaitu Sod Asetat yang berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA, maka ion-ion seperti kation Na+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion+ (Na+) dan- (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. Sehingga penambahan pelarut organik seperti ethanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. Berikut perbandingan bila DNA plasmid berada dalam air dan ethanol

Setelah penambahan ini, maka supernatan di dalam kedua larutan tersebut dimasukkan ke dalam freezer selama kurang lebih 1 jam. Tahap akhir dari presipitasi adalah sentrifuge supernatan beserta campurannya dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Hasil yang diperoleh adalah pelet yang mengandung DNA plasmid dan supernatan yang mengandung larutan NaOAc dan ethanol absolut. Sehingga, yang diambil pada tahap ini adalah bagian pellet dan yang dibuang adalah bagian supernatan.

Saat tahap presipitasi dilakukan ternyata didapatkan endapan/gumpalan putih yang merupakan protein menurutb keterangan dosen pembimbing. Hal ini juga mungkin berkaitan dengan langkah sebelumnya, atau mungkin saat pengambilan supernatan setelah penambahan larutan A, larutan B, dzan larutan C, pellet ikut terambil sehingga didapatkan plasmid yang sangat tidak murni

Tahap terakhir adalah tahap pembilasan DNA plasmid yang diperoleh dengan cara menambahkan 2 ml ethanol 70 % . Tujuannya yaitu untuk membersihkan sisa- sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh plasmid yang murni. Kemudian membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit. Setelah itu, menambahkan 50 mikrolit dH2O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur. Langkah terakhir, memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.