ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MIKROBA PERUSAK

A.    Apa Itu Isolasi Dan Identifikasi Mikroba

Isolasi mikroorganisme merupakan suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba di luar dari lingkungan alamiahnya yang bertujuan untuk memperoleh biakan bakteri yang tdiak bercampur dengan bakteri yang lainnya atau yang biasa disebut dengan istilah biakan murni. Sedangkan identifikasi mikoba merupakan usaha atau metode yang dilakukan untuk mengetahui secara rinci aktivitas-aktivitas yang terjadi pada mikroba tersebut.

B.     Mikroba Perusak

Mikroorganisme tersebar luas di alam dan sebagai akibatnya produk pangan jarang sekali yang steril, tetapi umumnya tercemar oleh berbagai jenis mikroorganisme. Pertumbuhan mikroorganisme dalam bahan pangan dapat mengakibatkan perubahan fisik atau kimia yang tidak diinginkan, sehingga bahan pangan tersebut tidak layak dikonsumsi.

Untuk dapat tumbuh dan berfungsi secara normal, mikroorganisme membutuhkan sumber energi, sumber nitrogen, vitamin, mineral dan faktor pertumbuhan lainnya. Komponen-komponen tersebut diperoleh mikroba dari bahan pangan, sehingga makanan menjadi rusak. Mikroba dapat mencemari pangan melalui air, debu, udara, tanah, alat-alat pengolah (selama proses produksi atau penyiapan)  juga  sekresi dari usus manusia atau hewan. Penyakit akibat pangan (food borne diseases) yang terjadi segera setelah mengkonsumsi pangan, umumnya disebut dengan keracunan.

Pangan  dapat menjadi beracun karena telah terkontaminasi oleh bakteri patogen yang kemudian dapat tumbuh dan berkembang biak selama penyimpanan, sehingga mampu memproduksi toksin yang dapat membahayakan manusia. Selain itu, ada juga makanan yang secara alami sudah bersifat racun seperti beberapa jamur/tumbuhan dan hewan. Umumnya bakteri yang terkait dengan keracunan makanan diantaranya adalah Salmonella, Shigella, Campylobacter, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolityca, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Vibrio cholerae. Vibrio parahaemolyticus, E.coli enteropatogenik dan Enterobacter sakazaki.

C.      Metode-Metode yang Digunakan dalam Mengisolasi dan Mengidentifikasi Mikroba Perusak

Dalam rangka pengawasan mutu secara mikrobiologis, dilakukan pengujian laboratorium untuk mengisolasi dan mengidentifikasi cemaran bakteri patogen yang mungkin ada.

Hal yang harus diperhatikan dalam pengujian untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri perusak pada bahan pangan yaitu :

1. 1.      Sampel

            Jumlah sampel yang diuji harus cukup representatif atau benar-benar mewakili mikroba yang akan diperiksa. Sampel makanan  yang diterima harus segera diuji begitu tiba di laboratorium. Sampel yang didinginkan dan mudah rusak harus dianalisa paling lambat 36 jam sesudah pengambilan sampel. Sampel beku harus disimpan dalam freezer sampai tiba waktunya untuk diuji, tetapi bila sampel diterima dalam keadaan dingin, jangan disimpan didalam freezer. Beberapa bakteri seperti vibrio banyak yang akan mati pada suhu sangat rendah (pembekuan). Untuk sampel yang tidak mudah rusak seperti makanan kaleng, dapat disimpan pada suhu ruang. Namun demikian, sampel tidak boleh disimpan terlalu lama karena ada mikroba yang dapat mati selama penyimpanan.

Sampel yang akan dikirim ke laboratorium harus diupayakan tidak tercemar dengan bahan atau mikroba lain terhadap sampel. Selama dalam pengiriman ke laboratorium maka sifat sampel harus dijamin tidak mengalami perubahan sejak sampel diambil, dikemas dan dikirim ke laboratorium.

Bila sampel berada dalam keadaan beku, harus terlebih dahulu dilelehkan dan pelelehan sedapat mungkin dilemari pendingin atau pada suhu kurang dari 450C selama paling lama 15 menit. Bila menggunakan suhu tinggi sebaiknya sampel diaduk secara teratur. Untuk sampel beku yang mudah meleleh seperti es krim, maka dapat diuji tanpa dilelehkan terlebih dahulu. Untuk sampel padat seperti daging mentah, harus terlebih dahulu dicincang sebelum dihomogenkan.

Khusus untuk pengujian C.botulinum dilarang untuk mencicipi ketika akan membuat pemerian sampel, maka pada catatan data sampel tidak dicantumkan pemerian dari rasa.

Metode Pengujian sampel makanan akan selalu mengacu kepada persyaratan makanan yangsudah ditetapkan. Parameter uji mikrobiologi pada makanan yang dipersyaratkan secara umum terdiri dari :

1. Uji Angka Lempeng Total
2. Uji Angka Kapang khamir
3. Uji Angka Bakteri termofilik
4. Uji Angka Bakteri pembentuk spora
5. Uji Angka bakteri an-aerob
6. Uji Angka Staphylococcus aureus
7. Uji Angka Clostridium perfringens
8. Uji Angka Enterococcus
9. Uji Angka Bacillus cereus
10. Uji Angka Enterobacteriaceae
11. Uji MPN Coliform
12. Uji MPN Fekal Coliform
13. Uji MPN Escherichia coli
14. Uji Angka Escherichia coli
15. Identifikasi Escherichia coli
16. Identifikasi Staphylococcus aureus
17. Identifikasi Salmonella
18. Identifikasi Shigella
19. Identifikasi Bacillus cereus
20. Identifikasi Streptococcus faecalis
21. Identifikasi Vibrio cholerae
22. Identifikasi Vibrio parahaemolyticus
23. Identifikasi Clostridiumperfringens
24. Identifikasi Listeria monocytogenes
25. Identifikasi Campylobacter jejuni

Ada beberapa parameter yang tidak termasuk dalam persyaratan diatas, seperti identifikasi Pseudomonas aeruginosa dalam air minum tetapi sering juga menjadi syarat tambahan yang diinginkan oleh produsen air minum untuk diuji.

Pengujian mikrobiologi untuk makanan tidak dilakukan untuk semua parameter uji diatas  tetapi akan mengacu pada persyaratan dari tiap produk tersebut misalnya persyaratan Naget ayam ( SNI 01-6683-2002) meliputi :

1. Angka Lempeng Total

2. MPN Coliform

3. MPN E.coli

4. Identifikasi Salmonella

5. Angka Staphylococcus aureus

1.  2.      Metode

Metode yang digunakan untuk pengujian mikrobiologi sangat ditentukan oleh persyaratan yang diacu, umumnya pengujian dilakukan secara kualitatif dengan metode pengkayaan (enrichment) yaitu isolasi dan identifikasi mikroba dan interpretasi hasil (negatif per gram/ml atau negatif per 25 gram atau per 100 gram/ml). Pengujian secara kuantitatif (enumerasi) dengan penghitungan jumlah mikroba dan interpretasi hasil berupa koloni per ml/g atau koloni per 100 ml. Identifikasi mikroba pathogen dapat dilakukan dengan cara konvensional maupun dengan pengujian cepat (rapid test).

2.1  Metode kuantitatif (Enumerasi)

Metode kuantitatif digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel, umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Paling Mungkin atau Most Probable Number (MPN).

Uji Angka Lempeng Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visualdan dihitung, interpretasi hasil berupa angka dalam koloni(cfu) per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar.

Angka Paling Mungkin (MPN) menggunakan media cair dengan tiga replikasi dan hasil akhir berupa kekeruhan atau perubahan warna dan atau pembentukan gas yang juga dapat diamati secara visual, dan interpretasi hasil dengan merujuk kepada Tabel MPN. Dikenal 2 cara  yaitu metode 3 tabung dan metode 5 tabung.

Metode kuantitatif  dilakukan dengan beberapa  tahap yaitu :

• Homogenisasi sampel, sebagai tahap pendahuluan dalam pengujian  yang berguna untuk membebaskan sel bakteri yang mungkin terlindung partikel sampel dan untuk memperoleh distribusi bakteri sebaik mungkin. Homogenisasi dapat dilakukan menggunakan alat seperti stainless steel blender atau stomaker. Sedang sampel bentuk cair tidak perlu menggunakan alat,  cukup langsung dicampur dengan pengencer dan dikocok sampai homogen.

• Tahap pengenceran, menggunakan larutan pengencer yang berfungsi untuk menggiatkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin kehilangan vitalitasnya karena kondisi di dalam sampel yang kurang menguntungkan. Pengenceraan suspensi sampel dilakukan untuk mendapatkan koloni yang tumbuh secara terpisah dan dapat dihitung dengan mudah, hal ini akan sangat membantu terutama untuk sampel dengan cemaran yang sangat tinggi. Umumnya pengencer yang digunakanadalah peptone water 0,1%, buffer fosfat atau larutan ringers  (4 kali kuat), dan peptone 0,1% plus NaCL 0,85% (ISO 6887:1983)

• Tahap pencampuran dengan media (padat/ cair), media padat yang digunakan umumnya adalah Plate Count Agar (PCA) atau Nutrient Agar (NA)  sedangkan untuk inokulasi suspensi homogenat sampel ke dalam media, tergantung dengan metode yang telah dipilih dan kesesuaian dengan sifat sampel dan mikroba yang mungkin ada dalam sampel. Pada keadaan tertentu, media perlu ditambah dengan bahan lain seperti glukosa untuk Enterococcus, atau serum untuk Mycoplasma dan egg yolk. Untuk bakteri tertentu misalnya yang tidak tahan panas terutama untuk pencampuran dengan media dengan suhu  kira-kira 450C, dilakukan dengan metode sebar atau tetes dan suhu inkubasi rendah (misal. bakteri Psychrotroph dan Psychrophiles)

• Tahap inkubasi dan pengamatan. Inkubasi dilakukan pada suhu dan lama yang sesuai dan kondisi dibuat sedemikian rupa disesuaikan  dengan sifat mikroba (kondisi aerob atau anaerob)(ISO 4833:1991) :
• 0 -10⁰C  untuk bakteri Psikrotrof dan Psikrofil
• 20-32⁰C  untuk bakteri Saprophtic mesophiles
• 35-37⁰C (atau 45⁰C) untuk bakteri  parasites mesofil
• 55-63⁰C atau lebih tinggi untuk bakteri  Termofilik
• 30-32⁰C
• Interpretasi hasil.

2.2  Metode Kualitatif (Pengkayaan)

            Pada metode kualitatif  dilakukan perbanyakan (enrichment/ pengkayaan)  terlebih dahulu dari sel mikroba yang umumnya dalam jumlah  yang sangat sedikit dan bahkan kadang-kadang dalam kondisi lemah. Ada beberapa tahap yang dilakukan yaitu tahap pengkayaan (enrichment), tahap isolasi  pada media selektif, tahap identifikasi dengan reaksi biokimia, dan dilanjutkan dengan analisa antigenik atau serologi atau immunologi dan bila diperlukan dapat juga dilakukan identifikasi DNA bakteri dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction).

• Tahap pengkayaan

            Umumnya digunakan media cair yang berguna untuk memberi kesempatan supaya bakteri dapat tumbuh pada media pengkaya, karena bakteri lain juga dapat tumbuh, maka dapat ditambahkan inhibitor untuk mencegah atau menghambat pertumbuhan bakteri lain dan dilanjutkan dengan menumbuhkan kembali bakteri dalam media selektif atau differensial. Pada keadaan tertentu dimana bakteri sangat lemah perlu dilakukan terlebih dahulu tahap pra-pengkayaan (pre-enrichment) misalnya pada uji Salmonella ataupun Enterobacter sakazaki, dimana media ini  mengandung cukup gizi yang non selektif. Tahap ini dimaksudkan untuk “menyembuhkan/ menguatkan” sel bakteri yang sangat lemah atau sakit disebabkan oleh proses pengolahan makanan. Umumnya pada tahap pra-pengkayaan digunakan media Lactose Broth atau Buffered Pepton Water, walaupun kadang-kadang media ini belum tentu sesuai untuk semua jenis sampel.

Pada makanan kering seperti yeast dan susu bubuk,  sampel hanya memerlukan rekonstitusi dalam air suling yang mengandung Brilliant Green. Sedangkan untuk sampel yang sangat berlemak seperti hasil olahan jeroan maka ke dalam media pra-pengkaya ditambahkan Tergitol 7 sehingga memudahkan dispersi lemak pada media.

• Tahap isolasi

            Setiap koloni atau galur mikroba yang akan diidentifikasi harus benar benar murni dan untuk mendapatkan biakan murni digunakan media selektif  yang memungkinkan untuk isolasi koloni mikroba tersangka berdasarkan pada karakter biokimia dari mikroba yang akan mempengaruhi sifat pertumbuhan bakteri pada suatu media spesifik. Identitas mikroba dapat dilihat dari pembentukan koloni  yang spesifik pada media. Saat ini,  perkembangan metode pengujian cepat (rapid test) dengan menggunakan media selektif sudah makin berkembang dimana pada media sudah ditambahkan suatu indikator/ bahan kimia tertentu  yang dapat menandai adanya hasil reaksi enzimatis sehingga terbetuk warna atau fluoresensi sehingga media tersebut lebih spesifik lagi (misalnya media kromokult dan fluorokult). Contohnya  media fluorogenik untuk deteksi  E.coli dan kromogenik  untuk deteksi E.sakazakii yang sangat spesifik. Hal ini berdasarkan pada enzim yang berasal dari bakteri tersebut misalnya E.coli (-D- galaktosidase) dengan penambahan fluorogenic substrat 4-methylumbellliferyl—D- glucoronide akan suatu ikatan kompleks yang akan menghasilkan  fluoresensi bila dilihat dibawah  cahaya ultraviolet dan  E.sakazakii  (-D- glukosidase) dengan substrat 5- Bromo-4-choloro-3-indolyl—D-glucopyranoside) akan menghasilkan koloni dengan warna hijau torquise . Beberapa media selektif yang digunakan untuk pengujian  mikroba dan koloni spesifik dapat dilihat pada Tabel 1.

Keterangan Gambar :

1. Enterobacter sakazakii dalam Enterobacter sakazakiiagar
2. Salmonella sp pada XLD Agar
3. Yersinia pada SS Agar
4. Vibrio cholerae pada TCBS Agar
5. Staphylococcus aeureus pada Manitol Salt Agar
6. Shigella pada S6 Agar
7. E.Coli pada EMB Agar
8. Bacillus cereus pada MYP Agar
9. C.perfingens pada TSC Agar

·         Pewarnaan Gram

Selain isolasi dan identifikasi dilakukan juga pewarnaan Gram langsung terhadap koloni, baik Gram positif maupun Gram negatif.

·         Tahap konfirmasi

Dilakukan dengan berbagai metode diantaranya :

• Konfirmasi dengan reaksi biokimia menggunakan media tertentu, karena setiap bakteri mempunyai karakter biokimia spesifik.
• Konfirmasi analisa antigenik
• Tahap selanjutnya merupakan identifikasi lebih sempurna yaitu typing secara bakteriofag atau identifikasi menggunakan analis dengan DNA probe ataupun metode PCR (Polymerase Chain Reaction).