METODA KROMATOGRAFI

Oleh : Haiyul Fadhli

Metoda Kromatografi

            Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Teknik kromatografi telah berkembang dan telah digunakan untuk memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen yang kompleks, baik komponen organik maupun komponen anorganik (Ganjar dan Rohman, 2007).

2.5.2.1 Kromatografi lapis tipis

            Kromatografi lapis tipis merupakan metoda pemisahan fisikokimia. Lapisan yang memisahkan, terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), dan larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Campuran yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa noktah atau pita dan pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (Stahl, 1985).

            Untuk dapat menghitung jarak yang ditempuh oleh noktah maka harus diketahui lokasi noktah pada plat dengan tepat. Untuk noktah yang bewarna dapat dilihat secara visual, tetapi untuk noktah yang tidak berwarna dapat diamati dengan cara menggunakan sinar lampu UV, uap iodium dan pereaksi penampak noda.

            Noktah yang telah didapat diberi tanda. Gunanya adalah untuk mencari harga Rf.

	Jarak titik pusat bercak dari titik awal
Rf =
	Jarak garis depan dengan titik awal

2.5.2.2 Kromatografi kolom

Kromatografi kolom merupakan salah satu metoda kromatografi dengan fase gerak cair dan fase diam padat. Penggunaan fase gerak (eluen) disesuaikan dengan kepolaran senyawa yang akan dipisahkan.

            Fase diam ditempatkan dalam tabung kaca berbentuk silinder, pada bagian bawah tertutup dengan katup atau kran dan fase gerak dibiarkan mengalir ke bawah melaluinya karena gaya berat. Pada kondisi yang dipilih dengan baik, eluen yang merupakan komponen campuran, turun berupa pita dengan laju yang berlainan dan dengan demikian dipisahkan. Eluen biasanya dipisahkan dengan cara membiarkannya mengalir keluar dari kolom dan mengumpulkannya sebagai fraksi. Jenis adsorben yang paling banyak digunakan dan mudah didapat berupa alumina dan silika gel (Gritter et al.,1991).

Kolom kromatografi dapat dibagi menjadi dua kelompok besar yaitu (Gritter et al., 1991) :

a.    Kolom analitik dengan diameter 2-6 mm dan panjangnya tergantung pada kemasan. Untuk kemasan partikel biasanya panjang kolom 50-100 cm dan untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya panjang kolom 10-30 cm.

b.    Kolom preparatif umumnya dengan diameter 5 cm atau lebih dan panjangnya 25-100 cm

2.5.2.3 Kromatografi cair vakum

            Kromatografi cair vakum atau vacuum liquid chromatography (VLC) pertama kali diperkenalkan oleh Coll et al., pada tahun 1977. Kromatografi vakum cair menggunakan silika gel 60 (63-200 μm, Merck®). Kolom kromatografi dikemas kering (biasanya dengan penyerap mutu 10-40 μm, Merck®) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi (Hostettmann et al., 1997).

            Teknik ini berdasarkan pertimbangan pada kromatografi lapis tipis preparatif yang dijalankan dalam bentuk kolom kromatografi dengan menggunakan vakum untuk mempercapat aliran eluen. Ini berbeda dengan flash chomatography, dalam kolom VLC dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi kemudian dikeringkan dan dielusi kembali dengan eluen yang lebih polar (Hostettmann et al., 1997).

2.5.2.4 Kromatografi radial (Kromatotron)

Kromatotron memiliki prinsip sama seperti kromatografi klasik dengan aliran fase gerak yang dipercepat oleh gaya sentrifugal. Kromatografi jenis ini menggunakan rotor yang dimiringkan dan terdapat dalam ruang tertutup oleh plat kaca kuarsa, sedangkan lapisan penyerapnya berupa plat kaca yang dilapisi oleh silika gel. Plat tersebut dipasang pada motor listrik dan diputar dengan kecepatan 800 rpm. Pelarut pengelusi dimasukkan ke bagian tengah alat sehingga dapat mengalir dan merambat karena gaya sentrifugal. Untuk mengetahui jalannya proses elusi dimonitor dengan lampu UV. Gas Nitrogen dialirkan kedalam ruang plat untuk mencegah pengembunan pelarut pengelusi dan mencegah sampel teroksidasi. Pemasukan sampel itu diikuti dengan pengelusian menghasilkan pita-pita komponen berupa lingkaran. Pada tepi plat, pita-pita akan terputar keluar dengan gaya sentrifugal dan ditampung dalam botol (Hostettmann, 1995).

2.5.2.4 Kromatografi ekslusi

            Kromatografi ekslusi disebut kromatografi permeasi gel jika digunakan fase gerak organik atau kromatografi filtrasi gel jika digunakan fase gerak yang mengandung air, adalah metoda pemisahan yang tergantung pada pertukaran molekul terlarut di antara pelarut fase gerak dalam  pori-pori bahan pengisi kolom menentukan rentang ukuran molekul pada pemisahan yang terjadi (Anonim, 1995).

2.5.2.4 Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak- puncaknya terpisah.