UJI BATAS MIKROBA

A.    UJI ENUMERASI MIKROBA

Pendahuluan

Bab ini menjelaskan tentang pengujian kuantitatif untuk bakteri mesofil dan kapang yang dapat tumbuh pada kondisi aerob. Pengujian ini dirancang untuk menentukan suatu bahan atau sediaan memenuhi spesifikasi mutu secara mikrobiologi yang telah ditetapkan, termasuk jumlah sampel yang akan digunakan dan interpretasi hasil uji. Metode ini tidak dapat diaplikasikan untuk produk yang mengandung mikroba viabel sebagai bahan aktif. Prosedur mikrobiologi lain termasuk metode otomatisasi dapat digunakan setelah dibuktikan kesetaraannya dengan metode farmakope.

Prosedur Umum

 Pengujian dilakukan pada kondisi aseptik sebagai tindakan pencegahan untuk menghindari kontaminasi mikroba dari luar produk, tetapi tidak mempengaruhi mikroba yang diuji. Jika produk mempunyai aktifitas antimikroba sebelum diuji lakukan netralisasi menggunakan inaktivator yang telah dibuktikan tidak toksik terhadap mikroba yang diuji.

 Metode Penghitungan

 Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan Membran atau salah satu Metode Angka Lempeng yang sesuai. Metode lain adalah Angka Paling Mungkin (APM) yang umum digunakan untuk produk dengan tingkat kontaminasi rendah. Pemilihan metode pengujian berdasarkan beberapa faktor antara lain jenis produk yang diuji, persyaratan yang ditentukan dan ukuran sampel yang memadai untuk memperkirakan kesesuaian secara spesifik. Kesesuaian metode yang dipilih harus ditetapkan

Metode Penghitungan

Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan Membran atau salah satu Metode Angka Lempeng yang sesuai. Metode lain adalah Angka Paling Mungkin (APM) yang umum digunakan untuk produk dengan tingkat kontaminasi rendah. Pemilihan metode pengujian berdasarkan beberapa faktor antara lain jenis produk yang diuji, persyaratan yang ditentukan dan ukuran sampel yang memadai untuk memperkirakan kesesuaian secara spesifik. Kesesuaian metode yang dipilih harus ditetapkan.

UJI FERTILITAS, KESESUAIAN METODE PENGHITUNGAN DAN KONTROL NEGATIF

Ketentuan Umum

 Kemampuan metode untuk mendeteksi mikroba pada produk harus ditetapkan. Jika terjadi perubahan kinerja pengujian pada produk yang mempengaruhi hasil uji, maka harus dilakukan verifikasi terhadap kesesuaian metode.

Penyiapan Galur Mikroba Uji

 Gunakan suspensi mikroba uji terstandar yang stabil. Galur mikroba uji dipelihara dengan Teknik Biakan Lot Benih tidak lebih dari 5 pasase dari master lot benih asli. Biakkan tiap galur bakteri dan kapang uji secara terpisah seperti tertera pada Tabel 1. Untuk membuat suspensi mikroba uji gunakan Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0 atau Dapar fosfat pH 7,2; untuk memisahkan spora Aspergillus brasiliensis tambahkan polisorbat 80 P 0,05% pada dapar. Gunakan dapar dalam waktu 2 jam atau dalam 24 jam jika disimpan pada 2º – 8º. Setelah dipilih untuk menyiapkan suspensi segar sel vegetatif A.brasiliensis atau B.subtilis, siapkan suspensi spora yang stabil dan gunakan untuk inokulum dalam pengujian dengan volume yang sesuai. Suspensi spora yang stabil dipelihara pada 2º – 8º untuk jangka waktu yang tervalidasi.

Kontrol Negatif

 Untuk membuktikan kesesuaian kondisi pengujian, kontrol negatif dilakukan menggunakan pengencer yang sesuai seperti pada penyiapan larutan uji. Tidak boleh terjadi pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif dilakukan pada saat pengujian seperti tertera pada Pengujian Sediaan. Kegagalan kontrol negatif memerlukan investigasi.

Fertilitas Media

Uji setiap bets media jadi dan setiap bets media yang dibuat dari media kering atau dari bahan yang tertera pada formula. Inokulasi sejumlah kecil mikroba (tidak lebih dari 100 koloni per plate) ke dalam Soybean-Casein Digest Broth, Soybean-Casein Digest Agar dan Sabouraud Dextrose Agar seperti tertera pada Tabel 1. Inkubasi sesuai dengan kondisi yang tertera pada Tabel 1. Untuk media padat, pertumbuhan yang diperoleh tidak boleh berbeda dua kali dari nilai hitung inokulum standar. Pertumbuhan mikroba dan hasil uji fertilitas pada inokulum yang dibuat segar harus sebanding dengan bets sebelumnya. Media cair dapat digunakan jika pertumbuhan mikroba uji terlihat jelas dan sebanding dengan inokulum yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.

Kesesuaian Metode Penghitungan Mikroba dalam Sediaan

PENYIAPAN SAMPEL

Metode penyiapan sampel disesuaikan dengan sifat fisik sediaan yang diuji. Jika dengan prosedur yang diuraikan di bawah ini tidak ada yang memuaskan maka harus dikembangkan prosedur lain yang sesuai.

Sediaan Larut Air

Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein Digest Broth bila perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu encerkan dengan pelarut yang sama. Sediaan Bukan Lemak yang Tidak Larut dalam Air

Suspensikan atau encerkan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein Digest Broth. Dapat ditambahkan surfaktan seperti Polisorbat 80 1 g per L untuk membantu mensuspensikan bahan yang sulit dibasahi, jika perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu encerkan dengan pelarut yang sama.

Sediaan Berlemak

Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji dalam isopropil miristat steril yang disterilkan dengan cara penyaringan atau campurkan sediaan yang akan diuji dengan sesedikit mungkin surfaktan Polisorbat 80 steril atau surfaktan noninhibitor lain steril, jika perlu hangatkan dalam tangas air pada suhu tidak lebih dari 40º atau pada kasus tertentu tidak lebih dari 45º. Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dalam tangas air. Tambahkan secukupnya pengencer yang telah dihangatkan hingga diperoleh pengenceran 1 dalam 10. Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dengan waktu sesingkat mungkin untuk pembentukan emulsi. Lakukan pengenceran bertingkat dengan pengencer yang sesuai mengandung surfaktan Polisorbat 80 P dengan kadar sesuai atau surfaktan non-inhibitor lain steril.

Cairan atau Padatan dalam bentuk Aerosol

 Pindahkan seluruh isi sediaan dengan cara aseptic dalam penyaring membrane atau wadah steril yang sesuai untuk pengambilan sampel. Gunakan seluruh isi atau sejumlah tertentu sediaan dari tiap wadah yang diuji.

“Transdermal Patches”

Lepaskan lapisan, letakkan bagian berperekat menghadap ke atas pada lempeng kaca steril atau baki plastik. Agar tidak saling menempel tutup permukaan berperekat dengan bahan berpori steril yang sesuai (misal kasa steril), kemudian pindahkan lembaran transdermal dalam wadah berisi pengencer yang mengandung polisorbat 80 P atau lesitin dengan volume yang sesuai. Kocok kuat selama tidak kurang dari 30 menit.

INOKULASI DAN PENGENCERAN

Tambahkan suspensi mikroba uji pada sampel dan suspensi kontrol (pengencer tanpa sampel) seperti tertera di atas, untuk mendapatkan inokulum dengan jumlah tidak lebih dari 100 koloni. Volume suspensi inokulum tidak lebih dari 1% dari volume sediaan yang diencerkan. Untuk menunjukkan perolehan kembali mikroba uji yang dapat diterima dari sediaan, faktor pengenceran terendah dari sampel yang disiapkan harus digunakan untuk pengujian. Jika hal tersebut tidak memungkinkan karena adanya aktifitas antimikroba atau kelarutan sediaan yang rendah, perlu dikembangkan protokol uji yang sesuai. Jika sifat penghambatan pertumbuhan dari sampel tidak dapat dihindari, maka jumlah total suspensi mikroba uji mungkin harus ditambah setelah proses netralisasi dengan pengenceran atau penyaringan. 

NETRALISASI/PENGHILANGAN AKTIFITAS ANTIMIKROBA

Jumlah perolehan kembali mikroba uji dari sampel yang disuspensikan seperti tertera pada Inokulasi dan Pengenceran, diinkubasi mengikuti prosedur yang tertera pada Perolehan kembali mikroba uji dalam sediaan, dibandingkan dengan jumlah mikroba uji yang diperoleh kembali dari suspensi kontrol. Jika pertumbuhan terhambat (dengan faktor reduksi lebih besar dari 2), maka lakukan perubahan prosedur untuk penghitungan khusus untuk meyakinkan validitas hasil. Beberapa contoh perubahan prosedur yaitu dengan : (1) Penambahan jumlah volume pengencer atau media biakan; (2) Penambahan larutan penetral khusus atau umum pada pengencer; (3) Penyaringan membran; atau (4) Kombinasi perubahan di atas.

 Zat Penetral

Zat penetral digunakan untuk menetralkan aktifitas senyawa antimikroba. (seperti tertera pada Tabel 2). Zat tersebut dapat ditambahkan pada pengencer atau media yang sesuai sebelum disterilkan. Jika digunakan metode tersebut, efikasi dan hilangnya toksisitas terhadap mikroba harus dibuktikan dengan melakukan penambahan zat penetral pada blangko tanpa sediaan Jika tidak dapat ditemukan metode netralisasi yang sesuai, dapat diartikan bahwa kegagalan isolasi mikroba yang diinokulasikan disebabkan oleh aktivitas antimikroba dari sediaan. Hal ini menunjukkan bahwa sediaan tidak terkontaminasi mikroba uji. Ulangi pengujian dengan pengenceran yang lebih tinggi yang sesuai dengan pertumbuhan mikroba uji dan kriteria penerimaan khusus.

PEROLEHAN KEMBALI MIKROBA UJI DALAM SEDIAAN

 Untuk tiap mikroba yang terdaftar, lakukan uji terpisah. Hanya mikroba yang ditambahkan yang dihitung.

Penyaringan Membran

 Gunakan penyaring membran dengan porositas tidak lebih dari 0,45 μm. Jenis bahan penyaring dipilih sedemikian rupa sehingga kemampuan menahan bakteri tidak dipengaruhi oleh kandungan sampel uji. Gunakan satu jenis membran penyaring untuk tiap mikroba uji. Pindahkan sejumlah suspensi sampel yang disiapkan seperti tertera pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/ Penghilangan Aktifitas Antimikroba (minimal mengandung 1 g sediaan, atau kurang jika diperkirakan jumlah koloni besar) saring segera dan bilas penyaring membran dengan sejumlah tertentu volume pengencer. Untuk menentukan angka lempeng total mikroba aerob (ALT), pindahkan penyaring membran ke permukaan lempeng media Soybean-Casein Digest Agar (SCDA). Untuk menentukan Angka Kapang Khamir (AKK), pindahkan membran ke permukaan lempeng media Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi cawan seperti tertera pada Tabel 1. Lakukan pengamatan dan penghitungan.

Metode Angka Lempeng Total

Metode angka lempeng total dilakukan setidaknya duplo untuk tiap media, dan hasil merupakan rata-rata hitung jumlah koloni.

Metode Tuang

Gunakan cawan Petri berdiameter 9 cm, inokulasikan 1 ml suspensi sampel seperti tertera pada Preparasi Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba ke dalam tiap cawan dan kemudian tambahkan 15 - 20 ml Soybean-Casein Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suhu tidak lebih dari 45°. Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar, sesuaikan jumlah media. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji yang tercantum pada Tabel 1. Inkubasi cawan seperti tertera pada Tabel 1. Hitung jumlah koloni rata-rata dari tiap cawan media dan jumlah koloni inokulum awal.

Metode Sebar

 Untuk lempeng media gunakan cawan Petri diameter 9 cm, diisi 15-10 ml Soybean-Casein Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suhu lebih kurang 45° pada tiap cawan Petri, dan biarkan memadat. Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar, sesuaikan jumlah media. Keringkan permukaan lempeng media dalam lemari laminar-airflow atau dalam inkubator. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji yang tertera pada Tabel 1. Inokulasikan 0,1 ml suspensi sampel yang disiapkan seperti pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/ Penghilangan Aktifitas Antimikroba dengan menyebarkan pada permukaan lempeng media. Inkubasi dan hitung jumlah koloni seperti telah dijelaskan pada Metode Tuang.

Metode Angka Paling Mungkin (APM)

Presisi maupun akurasi Metode APM kurang dibandingkan dengan Metode Penyaringan Membran atau Metode Angka Lempeng Total. Hasilnya tidak dapat diandalkan terutama untuk penghitungan khamir. Metode APM dapat digunakan untuk menghitung ALT jika tidak ada metode lain yang sesuai dan jika telah ditetapkan sebagai metode pilihan. Siapkan minimal tiga seri pengenceran (10-1, 10-2, 10- 3) suspensi sediaan dengan cara seperti tertera pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba. Dari tiap tingkat pengenceran suspensi sediaan inokulasikan masing-masing 1 ml ke dalam tiga seri tabung berisi 9 – 10 ml media Soybean-Casein Digest Broth. Jika perlu tambahkan surfaktan seperti polisorbat 80 P atau inaktivator zat antimikroba ke dalam media. Jika dibuat tiga tingkat pengenceran, maka diperoleh 9 tabung terinokulasi. Inkubasi semua tabung yang telah diinokulasi pada suhu 30° - 35° selama tidak lebih dari 3 hari. Jika terdapat kesulitan dalam membaca hasil, atau ketidakyakinan terhadap sifat dari sediaan yang diuji, lakukan sub-kultur pada media yang sama atau Soybean Casein Digestic Agar selama satu sampai 2 hari pada suhu yang sama, gunakan hasil ini. Dengan menggunakan Tabel 3 dapat ditentukan angka paling mungkin (APM) per g atau ml sediaan uji.

HASIL DAN INTERPRETASI

Jika ada kesesuaian antara Metode Penyaringan Membran atau Metode Angka Lempeng, hitung jumlah rata-rata mikroba uji dengan nilai penerimaan tidak lebih dari faktor 2 suspensi kontrol tanpa sediaan seperti tertera pada Inokulasi dan Pengenceran. Jika ada kesesuaian dengan Metode APM nilai inokulum yang dihitung harus dalam batas kepercayaan 95% dari nilai suspensi kontrol. Jika kriteria tersebut di atas tidak dapat dipenuhi untuk satu atau lebih mikroba yang diuji dengan metode tersebut di atas, maka metode dan kondisi uji harus mendekati kriteria yang digunakan untuk menguji sediaan.

PENGUJIAN SEDIAAN

Jumlah Sediaan yang Digunakan untuk Pengujian

Jika tidak dinyatakan lain gunakan 10 g atau 10 ml sediaan uji yang diambil dengan cara seperti di atas. Untuk sediaan cairan atau padatan dalam aerosol gunakan 10 wadah sampel, demikian juga untuk sampel “transdermal patches”. Jumlah yang diuji dapat dikurangi untuk sediaan dengan bahan aktif yang dibuat dalam tiap unit dosis (contoh tablet, kapsul, injeksi) kurang dari atau sama dengan 1 mg, atau jumlah per g atau ml (untuk penyiapan sampel tidak dalam unit dosis) kurang dari 1 mg. Dalam hal ini jumlah sampel yang diuji tidak kurang dari 10 unit dosis atau 10 g atau 10 ml sediaan. Untuk bahan aktif dengan jumlah sampel terbatas atau ukuran bets sangat kecil (misalnya kurang dari 1000 ml atau 1000 g) jumlah sampel yang diuji harus 1% dari bets kecuali jumlah yang lebih kecil ditentukan atau dinyatakan dan disetujui. Untuk sediaan dengan total keseluruhan bets kurang dari 200 unit (misal sampel untuk uji klinis), ukuran sampel dapat dikurangi menjadi dua unit atau satu unit jika kurang dari 100 unit. Ambil sampel secara acak dari ruahan sediaan atau dari wadah yang tersedia pada saat pengerjaan. Untuk mendapatkan jumlah yang diperlukan, campurkan sejumlah isi wadah hingga mencapai jumlah sampel yang cukup.

Pemeriksaan Sediaan

PENYARINGAN MEMBRAN

Gunakan alat penyaring yang dirancang sedemikian rupa sehingga memungkinkan pemindahan membran penyaring ke media. Siapkan sampel menggunakan metode yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan, pindahkan sejumlah yang sesuai pada dua penyaring membran, saring segera. Bilas tiap penyaringan sesuai dengan prosedur. Untuk menentukan ALT, pindahkan satu penyaring membran ke permukaan Soybean-Casein Digestic Agar. Untuk menentukan AKK, pindahkan satu penyaring membran yang lain ke permukaan Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi cawan Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5 hari dan cawan Sabouraud Dextrose Agar pada suhu 20° - 25° selama 5 - 7 hari. Hitung jumlah koloni per g atau per ml sediaan. Untuk pengujian sampel “transdermal patches”, secara terpisah saring 10% dari volume larutan seperti tertera pada Penyiapan Sampel, gunakan dua penyaring membran steril. Pindahkan satu membran pada Soybean- Casein Digest Agar untuk ALT dan membran lainnya pada Sabouraud Dextrose Agar untuk AKK.

METODE ANGKA LEMPENG

TOTAL Metode Tuang

Siapkan sampel menggunakan metode yang sesuai seperti tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan. Siapkan untuk masing-masing media sekurang-kurangnya dua cawan Petri untuk tiap tingkat pengenceran. Inkubasi cawan Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5 hari dan cawan Sabouraud Dextrose Agar pada suhu 20° - 25° selama 5-7 hari. Pilih cawan dari satu tingkat pengenceran dengan jumlah koloni tertinggi yang kurang dari 250 untuk ALT dan 50 koloni untuk AKK. Hitung jumlah rata-rata koloni dalam media biakan dan jumlah koloni per g atau per ml sediaan. Metode Sebar Siapkan sampel dengan metode yang sesuai seperti tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian cawan Petri untuk tiap media dan tiap tingkat pengenceran. Untuk inkubasi dan penghitungan jumlah koloni, lakukan seperti tertera pada Metode Tuang.

METODE ANGKA PALING MUNGKIN (APM)

Siapkan dan encerkan sampel dengan metode sesuai seperti tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan. Inkubasi semua tabung selama 3-5 hari pada suhu 30° - 35°. Jika perlu lakukan subkultur, gunakan metode yang sesuai. Catat jumlah tabung yang menunjukkan pertumbuhan mikroba pada tiap tingkat pengenceran. Tentukan APM mikroba per g atau ml sediaan berdasarkan Tabel 3.

Interpretasi Hasil

Angka Lempeng Total (ALT) dianggap sama dengan angka koloni yang ditemukan pada Soybean-Casein Digest Agar; jika koloni jamur ditemukan pada media ini, dihitung sebagai bagian dari jumlah ALT. Total jumlah kapang dan khamir (AKK) dianggap sama dengan jumlah koloni yang ditemukan pada Sabouraud Dextrose Agar; jika koloni bakteri ditemukan pada media ini, maka dihitung sebagai bagian dari AKK. Jika AKK diperkirakan melebihi kriteria penerimaan berdasarkan pertumbuhan bakteri, dapat digunakan Sabouraud Dextrose Agar yang mengandung antibiotik. Jika penghitungan dilakukan menggunakan metode APM, maka nilai penghitungan yang diperoleh merupakan angka total mikroba aerobik (ALT). Jika telah ditetapkan kriteria penerimaan untuk mutu mikrobiologi, maka di-interpretasikan sebagai berikut: - 101 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 20; - 102 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 200; - 103 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 2000; dan seterusnya. Larutan dan media yang disarankan tertera pada Uji Mikroba Khusus.

B. PENGUJIANMIKROBA SPESIFIK

PENDAHULUAN

Pada Bab ini akan dijelaskan tentang Uji Batas Mikroba Spesifik yang mungkin terdeteksi dengan kondisi dan metode yang sesuai. Metode uji dirancang untuk menetapkan suatu produk memenuhi kriteria mutu secara mikrobiologi. Untuk pelaksanaan pengujian ikuti petunjuk di bawah ini, termasuk jumlah sampel dan interpretasi hasil uji. Metode pilihan termasuk metode otomatik dimungkinkan untuk digunakan setelah dibuktikan kesetaraannya dengan metode farmakope.

PROSEDUR UMUM

Penyiapan sampel dilakukan seperti tertera pada Uji enumerasi mikroba. Jika produk yang akan diuji memiliki aktifitas antimikroba, sebaiknya sifat antimikroba dihilangkan atau dinetralkan seperti tertera pada Uji enumerasi mikroba. Jika digunakan bahan aktif permukaan (surfaktan) untuk penyiapan sampel, harus dapat dibuktikan sesuai dan tidak toksik bagi mikroba dan sesuai dengan inaktivator yang digunakan dalam produk yang diuji seperti tertera pada Uji enumerasi mikroba.

FERTILITAS DAN DAYA HAMBAT MEDIA, KESESUAIAN UJI DAN KONTROL NEGATIF

Kemampuan metode deteksi mikroba yang terdapat dalam produk yang diuji harus ditetapkan. Jika ada perubahan kemampuan dalam pengujian atau ada perubahan dalam produk yang dapat mempengaruhi hasil uji, harus dilakukan konfirmasi metode.

Penyiapan Galur Uji

Gunakan suspensi galur uji baku yang stabil. Galur uji dipelihara dengan Teknik Biakan Lot Benih tidak lebih dari 5 pasase dari master lot benih asli.

MIKROBA AEROB

 Biakkan masing-masing galur bakteri di bawah ini, pisahkan masing-masing dalam wadah berisi media Soybean-Casein Digest Broth atau Soybean-Casein Digest Agar, pada suhu 30⁰ - 35⁰ selama 18 - 24 jam. Biakkan galur uji Candida albicans dalam Sabouraud Dextrose Agar atau Sabouraud Dextrose Broth, pada suhu 20⁰ - 25⁰ selama 2 - 3 hari Gunakan Dapar Natrium Klorida–Pepton pH 7 atau Dapar Fosfat pH 7,2 untuk membuat suspensi uji. Gunakan suspensi tersebut dalam waktu 2 jam atau jika digunakan sampai 24 jamharus disimpan pada suhu 2° - 8°.

CLOSTRIDIA

Gunakan Clostridium sporogenes seperti ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) atau ATCC 19404 (NCTC 532 atau CIP 79.3). Biakkan galur uji Clostridia dalam keadaan anaerob pada Reinforce Medium for Clostridia pada suhu 30° - 35° selama 24 - 48 jam. Sebagai pilihan lain, siapkan dan encerkan sel vegetatif dalam bentuk suspensi segar. Suspensi spora stabil pada suhu 2° - 8° selama periode yang tervalidasi.

Kontrol Negatif

Untuk verifikasi kesesuaian kondisi pengujian, kontrol negatif dilakukan menggunakan pelarut yang sesuai menggantikan sediaan uji. Tidak boleh terjadi pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif juga dilakukan pada saat dilakukan uji terhadap sediaan seperti tertera pada Pengujian Sediaan. Apabila terjadi kegagalan pada kontrol negatif diperlukan investigasi.

Fertilitas dan Daya hambat Media

 Uji setiap bets media siap-pakai, media yang disiapkan dari media kering atau dari komponen media. Verifikasi sifat seperti tertera pada Tabel 1.

 Uji Fertilitas Media Cair

Inokulasikan ke dalam media yang sesuai, mikroba uji dalam jumlah sedikit (tidak lebih dari 100 koloni), inkubasi pada suhu tertentu, tidak lebih dari periode terpendek yang tertera pada prosedur uji. Untuk media cair, pertumbuhan mikroba uji harus terlihat jelas dan harus sama dengan inokulum yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.

Uji Fertilitas Media Padat

 Gunakan Metode Sebar seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji enumerasi mikroba. Inokulasikan masing-masing cawan dengan sejumlah mikroba uji yang sesuai (tidak lebih dari 100 koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu tidak lebih dari periode terpendek seperti tertera dalam prosedur uji. Pertumbuhan mikroba sama dengan inokulum yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.

Uji Daya Hambat Media Cair atau Padat

 Inokulasikan sejumlah mikroba uji paling sedikit 100 koloni pada sejumlah media yang diinkubasi pada suhu tertentu tidak kurang dari periode terpanjang seperti tertera pada Prosedur uji. Tidak boleh ada pertumbuhan mikroba uji.

“Test for Indicative Properties”

Gunakan Metode Sebar seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji enumerasi mikroba. Inokulasikan masing-masing cawan dengan mikroba sesuai (tidak boleh lebih dari 100 koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu dalam batas uji. Ciri koloni mikroba uji harus terlihat jelas dan harus sama dengan inokulum yang sebelumnya.

Kesesuaian Metode Uji

Untuk masing-masing sediaan baru yang diuji lakukan penyiapan sampel, seperti tertera pada Pengujian Sediaan. Pada saat inokulasi suspensi sampel, tambahkan masing-masing galur mikroba uji tidak lebih dari 100 koloni dalam media pertumbuhan yang telah ditentukan. Lakukan uji seperti tertera pada Pengujian Sediaan dengan masa inkubasi terpendek. Mikroba uji spesifik harus dapat dideteksi dengan reaksi dan sifat-sifat seperti dijelaskan dalam Pengujian Sediaan. Modifikasi prosedur uji untuk menetralkan aktifitas antimikroba harus dilakukan (tertera pada Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba dalam Uji Enumerasi Mikroba). Untuk sediaan yang telah diberi penetral aktivitas antimikroba dengan mengacu pada prosedur yang sesuai, dan ternyata aktivitas antimikroba tidak dapat dinetralkan, maka diasumsikan bahwa tidak ada mikroba yang terhambat dalam sediaan. 

PENGUJIAN SEDIAAN Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-negatif Penyiapan sampel dan pra-inkubasi

Siapkan sampel 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak lebih dari 1 g sampel diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba, gunakan Soybean-Casein Digest Broth sebagai pengencer, campur, dan inkubasi pada suhu 20° - 25° selama waktu yang cukup untuk menumbuhkan bakteri tetapi tidak cukup untuk memicu multiplikasi mikroba (biasanya 2 jam tapi tidak boleh lebih dari 5 jam).

Uji negatif

Kecuali dinyatakan lain dalam masingmasing monografi, gunakan 1 g sediaan seperti tertera pada Penyiapan Sampel dan Pra-inkubasi, dalam media cair pengkaya Enterobacteriaceae Mossel. Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 4 - 48 jam. Lakukan subkultur pada cawan Violet Red Bile Glucose Agar. Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam. Sampel memenuhi syarat bila tidak ada pertumbuhan koloni.

Uji Kuantitatif

Seleksi dan subkultur Inokulasi sejumlah suspensi dengan penyiapan sampel langsung ke dalam media Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Encerkan suspensi sampel hingga mengandung 0,1 g, 0,01 g dan 0,001 g (atau 0,1 ml, 0,01 ml dan 0,001 ml), dan inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 24 - 48 jam. Lakukan subkultur dengan menginokulasi masing-masing biakan pada cawan media Violet Red Bile Glucose Agar, inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 18 - 24 jam. Interpretasi Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan koloni. Catat hasil positif pada jumlah terkecil sediaan dan hasil negatif pada jumlah terbesar sediaan. Tentukan Angka PalingMungkin (APM) dari bakteri menggunakan Tabel 2. Kesesuaian Metode Uji, campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35 selama 18 - 24 jam.

Seleksi dan Subkultur

Kocok wadah, pindahkan 1 ml biakan Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 100 ml MacConkey Broth, inkubasi pada suhu 42° - 44 selama 24 - 48 jam. Inokulasi biakan MacConkey Broth pada cawan media Mac Conkey Agar, suhu 30° - 35 selama 18 - 72 jam.

Interpretasi

Pertumbuhan koloni menunjukkan adanya E.Coli yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

Salmonella Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi

Siapkan sediaan uji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan jumlah yang sesuai, tidak kurang dari 10 g atau 10 ml, inokulasi ke dalam sejumlah volume Soybean-Casein Digest Broth yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian Metode Uji), campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35 selama 18-24 jam.

Seleksi dan Subkultur

 Pindahkan 0,1 ml biakan Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 10 ml media Rappaport Vasiliadis Salmonella Enrichment Broth, inkubasi pada suhu 30° - 35 selama 18 - 24 jam. Subkultur pada cawan Xylose Lysine Deoxycholate Agar, inkubasi pada suhu 30° - 35 selama 18 - 48 jam.

Interpretasi

Pertumbuhan koloni berwarna merah, dengan atau tanpa titik hitam di bagian tengah menunjukkan karakteristik Salmonella yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh tidak seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

Pseudomonas aeruginosa Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi

Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak lebih dari 1 g sediaan diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 ml atau jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam media Soybean-Casein Digest Broth, dengan jumlah yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian Metode Uji), campur dan inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam. Untuk menguji “transdermal patches”, gunakan membran penyaring steril, saring sejumlah volume sampel yang sesuai dengan satu “patch” (lihat “Transdermal Patches” pada Penyiapan Sampel dalam Uji Enumerasi Mikroba) dan masukkan penyaring membran ke dalam 100 ml media Soybean-Casein Digest Broth. Inkubasi pada suhu 30° - 35 selama 18-24 jam.

Seleksi dan Subkultur

Lakukan subkultur pada cawan media Cetrimide Agar dan inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - 72 jam.

Interpretasi

Pertumbuhan koloni menunjukkan adanya P.aeruginosa yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh tidak seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

Staphylococcus aureus Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi

Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak kurang dari 1 g sediaan diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 ml atau jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam media Soybean-Casein Digest Broth, dengan jumlah yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian Metode Uji) campur dan inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam. Untuk menguji “transdermal patches”, gunakan membran penyaring steril, saring sejumlah volume sampel yang sesuai dengan satu “patch” (lihat “Transdermal Patches” pada Penyiapan Sampel dalamUji Enumerasi Mikroba) dan masukkan penyaring membran ke dalam 100 ml media Soybean-Casein Digest Broth. Inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam.

Seleksi dan Subkultur

Lakukan subkultur pada cawan media Mannitol Salt Agar dan inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - 72 jam.

Interpretasi

Pertumbuhan koloni berwarna kuning atau putih dikelilingi zona kuning menunjukkan adanya S.aureus yang di konfirmasi dengan uji identifikasi. Sediaan memenuhi syarat uji jika pertumbuhan koloni tidak seperti diuraikan atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

Clostridia Penyiapan Sampel dan Perlakuan Panas

Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer (dengan total volume minimum 20 ml) tidak kurang dari 2 g atau 2 ml sediaan untuk diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Pisahkan sampel menjadi dua bagian, sekurang-kurangnya 10 ml. Panaskan satu bagian pada 80 selama 10 menit, dinginkan dengan cepat. Satu bagian lainnya tidak dipanaskan.

Seleksi dan Subkultur

 Gunakan 10 ml atau jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml kemudian keduanya diinokulasi ke dalam sejumlah Reinforced Medium for Clostridia yang sesuai, (seperti tertera pada Kesesuaian Metode Uji). Inkubasi pada kondisi anaerob pada suhu 30 - 35 selama 48 - 72 jam.

Interpretasi

Pertumbuhan koloni anaerob bentuk batang (dengan atau tanpa endospora) memberikan reaksi katalase negatif, menunjukkan adanya Clostridia yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

Candida albicans Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi

Siapkan sediaan yang akan diuji seperti tertera pada Uji Endumerasi Mikroba. Gunakan 10 ml atau jumlah yang sesuai tidak kurang dari 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam 100 ml media Sabouraud Dextrose Broth, campur dan inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 3 - 5 hari.

Seleksi dan Subkultur

Lakukan subkultur pada cawan Sabouraud Dextrose Agar, dan inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 24 - 48 jam.

Interpretasi

Adanya pertumbuhan koloni berwarna putih menunjukkan adanya C.albicans. yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada pertumbuhan koloni seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi negatif.

LARUTAN DAN MEDIA KULTUR YANG DISARANKAN [Catatan Bagian ini sebagai informasi.] Larutan dan media kultur berikut memenuhi tujuan seperti tertera pada uji kontaminasi mikroba dalam Farmakope. Media lain mungkin dapat digunakan setelah kesesuaiannya dibuktikan.

Larutan Dapar Persediaan

Timbang 34 g Kalium Dihidrogen Fosfat P, masukkan ke dalam labu tentukur 1000ml, larutkan dalam 500 ml air, atur pH menjadi 7,2  0,2, tambahkan air murni sampai tanda, dan campur homogen. Masukkan ke dalam wadah, dan sterilisasi. Simpan pada suhu 2° - 8.

Larutan Dapar Fosfat pH 7,2

 Siapkan campuran air murni dan Larutan Dapar persediaan (800:1 v/v), kemudian sterilisasi. Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3  0,2 pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.  

Daftar Pustaka : Klik Disini